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發(fā)布于 2021年2月18日

原文：NAD tagSeq for transcriptome-wide identification and characterization of NAD⁺-capped RNAs

發(fā)表雜志：Nature Protocols

影響因子：10.4

原文鏈接：https://sci-hub.ren/10.1038/s41596-020-0363-z

導(dǎo)讀

研究發(fā)現(xiàn)幾種NCIN（noncanonical initial nucleotides）可以給RNA“加帽”，并可能調(diào)節(jié)RNA的穩(wěn)定性，轉(zhuǎn)錄和翻譯。NAD^?+是最近發(fā)現(xiàn)的NCIN之一，能夠給很多物種“加帽”。鑒定NAD⁺capped RNA（NAD-RNA）可能有助于揭示cap介導(dǎo)的調(diào)控機(jī)制。本文報(bào)道了一種稱為NAD tagSeq的方法，用于NAD-RNA的全基因組分析。真核mRNA的5’末端一般都包含一個(gè)甲基化的帽子（m7G）,在轉(zhuǎn)錄起始形成。帽子不僅保護(hù)5’-3’核酸酶對(duì)mRNA的降解，而且可以形成一個(gè)cap-binding復(fù)合體，介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程。最近研究發(fā)現(xiàn)RNA能被一系列非典型核苷酸衍生物加帽，比如NAD⁺，F(xiàn)AD，dpCoA，表明存在另一種帽子介導(dǎo)的基因調(diào)控。這些調(diào)控可能包括改變RNA的穩(wěn)定性，轉(zhuǎn)錄起始以及與參與mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白質(zhì)相互作用。NAD^?+是細(xì)胞氧化還原反應(yīng)中的核心輔酶，可能調(diào)節(jié)NAD-RNA的水平。但是，NAD-RNA的鑒定以及NAD ⁺cap介導(dǎo)的生物學(xué)功能在很大程度上是未知的。

1. NAD captureSeq

幾年前，開(kāi)發(fā)了NAD captureSeq，用于NAD-RNA的轉(zhuǎn)錄組范圍分析。在NAD captureSeq中，腺苷二磷酸核糖基環(huán)化酶（ADPRC）用于將NAD ⁺的煙酰胺部分替換為含炔烴的分子，稱為4-戊炔-1-醇。然后通過(guò)點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)（銅催化的疊氮炔炔環(huán)加成（CuAAC））將炔基化產(chǎn)物與生物素疊氮化物連接。用鏈霉親和素樹(shù)脂富集生物素標(biāo)記的RNA，然后制備通過(guò)二代測(cè)序技術(shù)（NGS）測(cè)序的cDNA文庫(kù)。陰性對(duì)照RNA樣品的處理方法相同，但不使用ADPRC。如果與陰性對(duì)照相比，在ADPRC處理的樣品中富集了特定的RNA，則其某些轉(zhuǎn)錄本被認(rèn)為是NAD ⁺?capped。通過(guò)NAD captureSeq，已在細(xì)菌，酵母，植物和人類細(xì)胞中鑒定出NAD-RNA。缺點(diǎn)：非生物素化的RNA與鏈霉親和素樹(shù)脂的非特異性結(jié)合。由于NAD-RNA水平很低，因此非特異性結(jié)合可能會(huì)顯著降低敏感性并引入誤差。在生物素標(biāo)記過(guò)程中RNA的斷裂以及隨后cDNA文庫(kù)的構(gòu)建導(dǎo)致NAD-RNA總體序列結(jié)構(gòu)信息的丟失。

2. CapZyme-Seq

CapZyme-Seq用于鑒定含有NAD⁺cap或其他非經(jīng)典caps的RNA。在這種方法中，RNA decapping酶（例如來(lái)自大腸桿菌的NudC）用于水解NCIN cap以形成5′-單磷酸RNA。然后將decapped的RNA與RNA寡核苷酸連接，而無(wú)法將m7G capped RNA與寡核苷酸連接。然后將與RNA寡核苷酸連接的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以通過(guò)高通量測(cè)序來(lái)擴(kuò)增和鑒定NCIN-capped RNA。缺點(diǎn)：在CapZyme-Seq中，NudC不僅會(huì)水解NAD ⁺?cap，而且還會(huì)裂解其他非經(jīng)典caps，因此很難區(qū)分是否NAD-RNAs。

3. NAD tagSeq

與NAD captureSeq一樣，NAD tagSeq方法也使用ADPRC催化的反應(yīng)和CuAAC反應(yīng)來(lái)標(biāo)記NAD-RNA。但是，NAD tagSeq不使用生物素標(biāo)記NAD-RNA，而是在點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)中使用與合成RNA tag綴合的疊氮化物，從而使NAD-RNA與RNA tag連接（圖1）。然后，通過(guò)利用ONT平臺(tái)直接對(duì)RNA進(jìn)行測(cè)序。RNA tag可作為NAD-RNA的標(biāo)識(shí)符，這意味著假定在其5’端包含tag序列的RNA read被NAD⁺capped。RNA tag還可以用于通過(guò)與具有互補(bǔ)序列的DNA寡核苷酸雜交，來(lái)富集標(biāo)記的RNA，富集步驟是可選的。通過(guò)富集，可以增加NAD-RNA的測(cè)序覆蓋率。如果不進(jìn)行富集，則通過(guò)納米孔測(cè)序來(lái)識(shí)別標(biāo)記和非標(biāo)記轉(zhuǎn)錄物，從而獲得NAD-RNA與總轉(zhuǎn)錄組的比率。NAD tagSeq方法還可以對(duì)來(lái)自相同基因的NAD-RNA和總轉(zhuǎn)錄本的相對(duì)豐度進(jìn)行定量。標(biāo)記步驟之后，通過(guò)使用聚腺苷酸化酶將poly（A）尾巴添加到所有RNA中，因?yàn)橹挥泻琾oly（A）的RNA可以通過(guò)牛津納米孔測(cè)序進(jìn)行測(cè)序（圖1）。結(jié)果，NAD-RNA在5’端被RNA tag標(biāo)記，在3’端被聚腺苷酸化，而其他RNA僅進(jìn)行聚腺苷酸化。然后，對(duì)所有RNA與RTA連接，逆轉(zhuǎn)錄和連接RNA測(cè)序接頭。最后，通過(guò)Nanopore直接進(jìn)行RNA測(cè)序。Guppy給出的reads后，需要鑒定NAD-RNA。堿基識(shí)別無(wú)法識(shí)別1,2,3-triazole附近的序列；因此，使用來(lái)自每個(gè)基因的tag和untagged的RNA分別代表NAD-RNA和noncapped RNA。由于tag RNA的長(zhǎng)度為40個(gè)核苷酸，并且連接會(huì)影響堿基識(shí)別，因此對(duì)前40個(gè)核苷酸中具有12個(gè)連續(xù)tag RNA核苷酸的reads，將它們歸類為tag RNA。然后將reads與參考基因組和轉(zhuǎn)錄組比對(duì)，以找出只存在于ADPRC⁺樣品中的基因。標(biāo)記的NAD-RNA的結(jié)構(gòu)可通過(guò)Integrative Genomics Viewer可視化。

圖1 NAD tagSeq的流程

4. NAD tagSeq實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

（1）使用model NAD-RNA驗(yàn)證標(biāo)記過(guò)程

為了分析RNA tag的標(biāo)記效率，作者使用T7 RNA聚合酶通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄合成了NAD-RNA模型（38個(gè)核苷酸）。NAD-RNA模型的轉(zhuǎn)錄是由T7 II類啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，并且只有第一個(gè)轉(zhuǎn)錄的核苷酸是腺苷，因此NAD +可以在5’末端的轉(zhuǎn)錄本中摻入。然后合成NAD-RNA使用PAGE凝膠純化。使用PAGE凝膠進(jìn)一步監(jiān)測(cè)model NAD-RNA的純度（圖2）。然后，model NAD-RNA與4-pentyn-1-ol進(jìn)行ADPRC催化的化學(xué)酶反應(yīng)，與tagRNA-疊氮化物（25個(gè)核苷酸）進(jìn)行CuAAC反應(yīng)。通過(guò)PAGE凝膠檢測(cè)產(chǎn)物，其中將缺乏ADPRC（ADPRC-）的反應(yīng)用作陰性對(duì)照。

?圖2 純化的model NAD-RNA的凝膠電泳

（2）用于NAD tagSeq的RNA樣品制備

RNA的片段化和降解會(huì)降低使用NAD tagSeq識(shí)別NAD-RNA的效率。對(duì)于RNA樣品制備，建議使用新鮮的組織提取RNA。或者，可以在獲得后立即在液氮中冷凍組織。建議在tag實(shí)驗(yàn)中使用100μg?RNA。

（3）用RNA?tag標(biāo)記NAD-RNA

為了進(jìn)行反應(yīng)，首先在ADPRC催化下，用接頭修飾model NAD-RNA或總細(xì)胞RNA。然后，與炔烴相連的RNA與特定的tagRNA-疊氮化物（40個(gè)核苷酸）進(jìn)行點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)。陰性對(duì)照，除了不添加ADPRC以外，以相同方式處理樣品。陰性對(duì)照的結(jié)果有助于評(píng)估RNA分子非特異性標(biāo)記產(chǎn)生的噪音。

（4）總RNA的聚腺苷酸化

納米孔直接RNA測(cè)序需要RNA包含poly（A）尾巴。如果將真核mRNA用作輸入樣品，則不需要聚腺苷酸化步驟。但是，如果研究的重點(diǎn)是其他類型的無(wú)聚腺苷酸尾巴的RNA，則需要進(jìn)行聚腺苷酸化。該步驟由poly（A）聚合酶催化，向每個(gè)RNA添加poly（A）尾，然后使用oligo dT磁珠純化RNA。

（5）富集NAD-RNA用于深度測(cè)序

此步驟是可選的，可進(jìn)行此操作以增加NAD-RNA的測(cè)序覆蓋度。標(biāo)記的NAD-RNA被固定在磁珠上的DNA寡核苷酸富集，并具有與RNA tag互補(bǔ)的序列。

（6）文庫(kù)制備和利用MinION進(jìn)行測(cè)序

通常，使用200–500 ng的RNA制備測(cè)序文庫(kù)。按照ONT公司的直接RNA測(cè)序方案，將RNA樣品與RTA連接，逆轉(zhuǎn)錄并與測(cè)序接頭連接，所有這些都可以通過(guò)納米孔直接RNA測(cè)序試劑盒完成。然后，可以在Nanopore測(cè)序設(shè)備上對(duì)生成的文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。使用MinKNOW軟件和Guppy數(shù)據(jù)處理工具包進(jìn)行堿基識(shí)別。

（7）從測(cè)序reads中鑒定NAD-RNA

盡管堿基識(shí)別軟件無(wú)法識(shí)別1,2,3-三唑鍵附近的序列，但Guppy給出的reads仍可通過(guò)tag RNA來(lái)確定NAD-RNA。在NAD tagSeq的原始應(yīng)用程序中，作者開(kāi)發(fā)了Python腳本，并結(jié)合了諸如Guppy和Minimap2（ref.）之類的可用工具來(lái)實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)分析。為了提高該方法的性能，建立了稱為TagSeqTools的計(jì)算流程。在這里，介紹了一組用于識(shí)別和定量NAD-RNA的詳細(xì)過(guò)程，該過(guò)程使用TagSeqTools和現(xiàn)有軟件（例如FastQC）。使用TagSeqTools中的TagSeek模塊區(qū)分NAD-RNA和非NAD RNA。

從TagSeek步驟生成的帶標(biāo)簽和不帶標(biāo)簽的reads可以接受TagSeqQuant，它使用Minimap2的默認(rèn)比對(duì)參數(shù)。在TagSeqQuant中，還通過(guò)FastQC對(duì)reads進(jìn)行質(zhì)量檢查，并生成一個(gè)html文件以顯示測(cè)序質(zhì)量。經(jīng)過(guò)上述分析步驟后，將生成NAD-RNA和非NAD-RNA的基因覆蓋文件，以進(jìn)行IGV可視化（圖3），并生成基因和isoforms的計(jì)數(shù)表以進(jìn)行進(jìn)一步分析。

圖3 NAD-RNA和noncapped-RNA reads可視化圖

5. NAD tagSeq的優(yōu)缺點(diǎn)

優(yōu)勢(shì)：首先，NAD tagSeq可以使用5’端的RNA tag作為有效的工具，以過(guò)濾掉一些假陽(yáng)性。在NAD captureSeq中，將非特異性結(jié)合鏈霉親和素樹(shù)脂的RNA分子與生物素標(biāo)記的RNA一起轉(zhuǎn)換為cDNA文庫(kù)。非特異性結(jié)合問(wèn)題也發(fā)生在NAD tagSeq中。但是，NAD tagSeq可以使用直接RNA測(cè)序通過(guò)RNA tag的存在來(lái)區(qū)分NAD-RNA與其他非特異性結(jié)合的NAD-RNA。其次，NAD tagSeq不需要像NAD captureSeq一樣的PCR程序，通過(guò)避免PCR引起的偏倚，可以使NAD-RNA的定量更加準(zhǔn)確。NAD tagSeq還允許定量總轉(zhuǎn)錄本中NAD-RNA的絕對(duì)豐度和相對(duì)豐度。第三，NAD tagSeq比NAD captureSeq更簡(jiǎn)單，因?yàn)榭梢栽跇?biāo)記后直接識(shí)別RNA，因此省去了制作cDNA文庫(kù)的整個(gè)過(guò)程。

第四，NAD tagSeq可以揭示NAD-RNA的整體序列。ONT測(cè)序技術(shù)允許將RNA分子從3’端到5’端測(cè)序。因此，可以揭示RNA分子的序列。它允許分析cap如何通過(guò)轉(zhuǎn)錄后修飾（如選擇性剪接或5’非翻譯區(qū)）調(diào)節(jié)RNA功能。

第五，將來(lái)可能會(huì)應(yīng)用通過(guò)合成RNA tag標(biāo)記NAD-RNA然后進(jìn)行直接RNA測(cè)序的想法，以開(kāi)發(fā)類似的方法來(lái)鑒定其他NICN-capped RNA，可以開(kāi)發(fā)特定的酶和/或點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)來(lái)標(biāo)記其他NCIN capped RNA。

局限性：納米孔測(cè)序從3’端到5’端，有時(shí)會(huì)導(dǎo)致reads被截?cái)?，這意味著RNA的5’區(qū)域可能未測(cè)序。因此，某些沒(méi)有RNA tag的reads可能來(lái)自NAD-RNA，這會(huì)引入一些假陰性。

此外，如果在標(biāo)記之前不進(jìn)行聚腺苷酸化步驟，RNA的斷裂（例如在銅離子存在下的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)期間）可能會(huì)導(dǎo)致假陰性。

NAD?tagSeq的另一個(gè)缺點(diǎn)是，由于ONT芯片的成本很高，它比NAD?captureSeq更為昂貴。此外，Oxford Nanopore測(cè)序平臺(tái)在對(duì)小RNA進(jìn)行測(cè)序方面存在局限性。獲得的短測(cè)序reads（不包括poly（A）尾部和RNA標(biāo)簽序列）約為80個(gè)核苷酸，這增加了一些小NAD-RNA可能被該分析遺漏的可能性。推測(cè)Illumina測(cè)序也可用于NAD tagSeq。但是，還需要進(jìn)一步測(cè)試逆轉(zhuǎn)錄酶是否可以通過(guò)RNA tag和NAD cap之間的joint以到達(dá)RNA tag區(qū)域。

總結(jié)

NAD tagSeq結(jié)合ONT direct RNA檢測(cè)方案可用于全基因組范圍內(nèi)的鑒定和定量，包括真核生物和原核生物在內(nèi)的不同生物體中的NAD RNA。它可用于比較不同樣品中的NAD-RNA圖譜，并分析細(xì)胞NAD-RNA的總體水平和單個(gè)NAD-RNA的水平。如果跳過(guò)tag RNA的富集，則該方法可產(chǎn)生同一基因中NAD-RNA的豐度和總轉(zhuǎn)錄本的信息。此外，NAD-RNA的整個(gè)序列結(jié)構(gòu)可以通過(guò)長(zhǎng)讀測(cè)序技術(shù)揭示出來(lái)。該技術(shù)可用于分析不同生理?xiàng)l件下的NAD-RNA，并將其與總轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組進(jìn)行比較，以揭示NAD RNA在介導(dǎo)基因表達(dá)中的可能作用。