Nanopore助力宮頸癌樣本中的HPV整合位點(diǎn)檢測(cè)

一、數(shù)據(jù)質(zhì)控

作者通過(guò)對(duì)目標(biāo)區(qū)域捕獲后進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，分別進(jìn)行Nanopore和Illumina測(cè)序，分別獲得130.2 Mb和1.64 Gb的clean?reads（圖1）。

?圖1

二、通過(guò)Nanopore和Illumina數(shù)據(jù)鑒定HPV整合位點(diǎn)

作者構(gòu)建Nanopore分析pipeline（圖2A），通過(guò)Blast與人和HPV16病毒基因組進(jìn)行比對(duì)，共識(shí)別339個(gè)整合位點(diǎn)，通過(guò)過(guò)濾篩選最終剩余60個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)的分析。Illumina測(cè)序共獲得1718個(gè)整合位點(diǎn)，篩選reads覆蓋度大于3的位點(diǎn)54個(gè)進(jìn)行后續(xù)分析。

?圖2

所有斷點(diǎn)在染色體上的分布見(jiàn)圖3A。染色體chr20、chr2、chr6分別由12、11和8個(gè)斷點(diǎn)，chr1和chrX均存在7個(gè)斷點(diǎn)，其余染色體斷點(diǎn)分布均在5以下。在每個(gè)位點(diǎn)上的reads覆蓋度從2~406不等，大約有31.7%以上的位點(diǎn)覆蓋深度在10以上。在top5的覆蓋深度位點(diǎn)中3個(gè)位于chr20（HPV16:2804,chr20:32516985 (406 reads)；HPV16:7139,chr20:32478733(169 reads)；HPV16:4276,chr20:32502143(51reads)），2個(gè)位于chrX（HPV16:5534,chrX:20464412 (132 reads)；HPV16:3163,chrX: 20462930 (50 reads)）。

圖3B展示了60個(gè)位點(diǎn)在HPV基因組上的分布，L2基因中有18個(gè)，L1中有12個(gè)，E1中有11個(gè)，E2中有7個(gè)，其他每個(gè)基因（E6，LCR，E5和E7）上小于4個(gè)。

在人基因組上，有38個(gè)位點(diǎn)在基因間區(qū)，18個(gè)位于內(nèi)含子區(qū)域，2個(gè)位于非編碼區(qū)域，1個(gè)位于外顯子區(qū)域，1個(gè)位于downstream區(qū)域。

進(jìn)一步分析人基因組上的位點(diǎn)分布，在chr20染色體上的12個(gè)位點(diǎn)中，有10個(gè)在基因CHMP4B和RALY-AS1之間，有一個(gè)位于KIF3B和ASXL1之間，最后一個(gè)位于基因ATRN的內(nèi)含子區(qū)域。除了chr20染色體外，其他染色體上也有明顯的位點(diǎn)聚集趨勢(shì)，例如，chrX染色體上的6個(gè)位點(diǎn)在基因RPS6KA3和CNKSR2之間，chr6染色體上的3個(gè)位點(diǎn)位于基因CAGE1的內(nèi)含子或者downstream區(qū)域。

圖3

三、在不同數(shù)據(jù)集中的位點(diǎn)差異

在Illumina測(cè)序獲得的54個(gè)整合位點(diǎn)中，有19個(gè)與之前報(bào)道的相符。整合所有位點(diǎn)并做韋恩圖（圖4），有13個(gè)位點(diǎn)是3種數(shù)據(jù)（Nanopore、Illumina、published）都存在的，這表明不同平臺(tái)間重復(fù)性很好。共有18個(gè)位點(diǎn)同時(shí)出現(xiàn)在Nanopore和Illumina中，三個(gè)位點(diǎn)同時(shí)出現(xiàn)在納米孔測(cè)序和以前發(fā)表的論文中，只有一個(gè)位點(diǎn)在Illumina和已發(fā)表的論文重疊。在兩個(gè)平臺(tái)中確定的整合位點(diǎn)中，一些斷點(diǎn)具有高度豐富的reads數(shù)，例如HPV16：2804，chr20：32516985，Nanopore結(jié)果中有406個(gè)reads，Illumina結(jié)果中有1439個(gè)reads。其他斷點(diǎn)的reads數(shù)很少，例如HPV16：4250，chr21：97550764，其中Nanopore結(jié)果中有兩個(gè)reads，而Illumina結(jié)果中只有四個(gè)reads。

除了重疊的位點(diǎn)外，每個(gè)平臺(tái)都有自己獨(dú)特的整合位點(diǎn)。 Nanopore、Illumina和文獻(xiàn)中，分別擁有26、22和2個(gè)唯一的整合位點(diǎn)。在Nanopore識(shí)別的26個(gè)位點(diǎn)中，其中6個(gè)reads支持度在6以上。因此，在Illumina，Nanopore和文獻(xiàn)這三種方法確定的整合位點(diǎn)中，Nanopore具有相對(duì)可靠的豐度，可以確定準(zhǔn)確的整合位點(diǎn)。

?圖4

作者為了測(cè)試數(shù)據(jù)確定的新整合位點(diǎn)的準(zhǔn)確性，利用Sanger測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證?？偣策x擇了14個(gè)整合位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證，并對(duì)13個(gè)進(jìn)行PCR擴(kuò)增并成功測(cè)序，表明這些整合位點(diǎn)的真正陽(yáng)性，這些陽(yáng)性位點(diǎn)大多由Nanopore和Illumina平臺(tái)鑒定。

圖5

四、受影響的基因功能分析

合并3種不同平臺(tái)的整合位點(diǎn)，并對(duì)整合完的83個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行注釋?zhuān)⑦M(jìn)行了進(jìn)一步的功能分類(lèi)和途徑分析。這些基因分為八個(gè)生物學(xué)過(guò)程，包括RNA聚合酶II啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄正調(diào)控（6個(gè)基因），RNA聚合酶II啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄負(fù)調(diào)控（6個(gè)基因），RNA聚合酶II啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控（5個(gè)基因）， RNA聚合酶II啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄（4個(gè)基因），視黃酸受體信號(hào)傳導(dǎo)途徑的負(fù)調(diào)控（2個(gè)基因），皮膚屏障的建立（2個(gè)基因），近端/遠(yuǎn)端模式形成（2個(gè)基因）和胚胎肢體形態(tài)發(fā)生（2個(gè)基因）六個(gè)胞質(zhì)（13個(gè)基因），核質(zhì)（8個(gè)基因），胞外外泌體（8個(gè)基因），蛋白質(zhì)結(jié)合（6個(gè)基因），DNA結(jié)合（2個(gè)基因）和肌動(dòng)蛋白結(jié)合（2個(gè)基因）。