Cell | 單細(xì)胞+空間轉(zhuǎn)錄組解析人類腸道發(fā)育的時(shí)空密碼

摘要

前言

研究結(jié)果

研究人員從代表了不同的發(fā)育時(shí)間和組織位置的17個(gè)單獨(dú)的胚胎中收集了77個(gè)腸道樣本繪制成單細(xì)胞圖譜 （Figures 1?A和1B），數(shù)據(jù)集范圍從8到22 PCW，跨越隱窩形成之前的時(shí)間點(diǎn)，直至成人狀絨毛/隱窩形態(tài)的發(fā)展（FiguresS1A）。使用寡核苷酸標(biāo)記抗體，產(chǎn)生了76,592個(gè)細(xì)胞 (Figures 1A 和 S1B–S1I; STAR methods)。

聚類分析將這些細(xì)胞分為9個(gè)腸道小室，以轉(zhuǎn)錄特征分別標(biāo)注-上皮細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞（EC），周細(xì)胞，神經(jīng)（ENS），肌瘤，間皮，肌成纖維細(xì)胞和免疫(Figures 1C 和 1D)，且具有明顯的區(qū)位和發(fā)育時(shí)間差異(Figures 1E 和 1F)。基于關(guān)鍵標(biāo)記基因進(jìn)行的精細(xì)聚類注釋進(jìn)一步確定了區(qū)室中的101個(gè)亞群，并利用基于圖的劃分抽象方法描述了它們之間的關(guān)系(Figure 1G; Table S1;STAR methods)。接下來，對(duì)轉(zhuǎn)錄因子(TF)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行映射，以突出每種細(xì)胞類型的關(guān)鍵調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并重建細(xì)胞命運(yùn)的“決策樹”(Figure S2A; STAR methods)。鑒定出了464個(gè)TF模塊(如上皮細(xì)胞發(fā)育中的ARID3A（FDR<2.2e-16、coeff= 0.350），成纖維細(xì)胞中TCF21 （FDR<2.22e-16, coeff = 0.299），概述了已知的發(fā)育調(diào)節(jié)劑（例如用于腸內(nèi)分泌細(xì)胞[EEC]分化的PAX4）以及306個(gè)發(fā)育發(fā)育階段和44個(gè)不同位置的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（例如，回腸末端的FOXD1?（FDR <2.22e-16，coeff = 0.026）(Figure S2B)。同樣，繪制了所有101種細(xì)胞類型之間的串?dāng)_圖，確定了成對(duì)細(xì)胞群之間的假定受體-配體（RL）相互作用（每個(gè)簇對(duì)多達(dá)179個(gè)旁分泌相互作用，包括2,252個(gè)RL對(duì)）(FigureS2?C;?STAR methods）。

對(duì)跨腸發(fā)育的組織進(jìn)行空間轉(zhuǎn)錄組分析（5個(gè)樣品中的8個(gè)切片; 12 PCW，n = 5; 19 PCW，n = 1;成人，n = 2）（Figure 1A）。ST斑點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄特征分析確定了每張幻燈片中的5-13個(gè)斑點(diǎn)簇，它們映射到離散位置(Figure2A)。使用單細(xì)胞圖譜作為參考，利用因子分析來確定每個(gè)斑點(diǎn)可能的scRNA-seq組成，從而在空間上定位所有scRNA-seq簇。與此同時(shí)，利用成人上皮細(xì)胞進(jìn)行scRNA-seq預(yù)測(cè)了成人和胎兒的空間細(xì)胞類型分布（GEO：GSE116222，GSE125970），基質(zhì)(GEO: GSE114374) 和免疫(DUOS-000110) 。

來自成年細(xì)胞群體（如隱窩頂部結(jié)腸細(xì)胞和成肌纖維細(xì)胞）的轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征也位于適當(dāng)?shù)慕馄饰恢茫‵igure2B）。RET顯示在肌間神經(jīng)叢和粘膜下淋巴濾泡的PTPRC（CD45）有斑點(diǎn)特異性表達(dá)（Figure 2B）。

成對(duì)細(xì)胞類型信號(hào)相關(guān)性分析強(qiáng)調(diào)了幾種細(xì)胞類型（如，BEST4 / OTOP2細(xì)胞和結(jié)腸細(xì)胞）的顯著同點(diǎn)共現(xiàn)，與預(yù)期的原位細(xì)胞定位一致（Figure2Ci）。大多數(shù)ST斑點(diǎn)簇是分層分布的，突出了與組織深度相對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)錄/細(xì)胞空間變異性的*大決定因素。

研究人員鑒定了2,893個(gè)與深度相關(guān)的基因（<5％FDR），反映了不同層次的活躍途徑(Figure Cii) -肌肉/神經(jīng)過程(收縮/軸突形成)向吸收管腔功能(微絨毛組織和消化系統(tǒng)過程)發(fā)展的深度富集點(diǎn)，與細(xì)胞類型特征的順序富集相符（Figure?2Ciii）。在胎兒ST顯著的差異包括外肌層和內(nèi)肌層在19個(gè)PCW時(shí)占據(jù)離散的空間層，而不是12個(gè)PCW時(shí)(Figure 2D)。

子宮上皮隱窩的形成建立了維持粘膜屏障的終生回路。該研究捕獲了17,622個(gè)上皮細(xì)胞，這些上皮細(xì)胞易于區(qū)分其吸收性（腸上皮細(xì)胞和BEST4/OTOP2細(xì)胞），分泌性（EEC，杯狀細(xì)胞和分泌性祖細(xì)胞），未分化（遠(yuǎn)距離擴(kuò)增[TA]和近端TA）以及干細(xì)胞（近端和遠(yuǎn)端ISC）基因標(biāo)簽（Figure 3A；Table S1）。吸收性細(xì)胞基因的表達(dá)反映了類似于成人上皮的成熟光譜。研究人員觀察到由高特異性基因表達(dá)（例如CCL25和APOE）（Figure3A和3B）劃定的近端（小腸[SI]）和遠(yuǎn)端（結(jié)腸）樣品之間的位置差異很大，通過軌跡分析和幾個(gè)TF模塊進(jìn)行了證實(shí)（FigureS3一種）。這表明，在隱窩形成之前，位置特異性轉(zhuǎn)錄程序就已經(jīng)建立起來了。

研究人員觀察到近端和遠(yuǎn)端ISCs隨著時(shí)間的推移逐漸增加。這與ISC轉(zhuǎn)錄程序的早期位置差異形成對(duì)比，例如遠(yuǎn)端LEFTY1和近端FOXD1及其下游調(diào)控網(wǎng)絡(luò)基因（Figure3C，3D和S3B）。這些差異由關(guān)鍵的位置信號(hào)轉(zhuǎn)通路支撐，例如，結(jié)腸LEFTY1通過激活素A受體（ACVR2B）參與了假定的神經(jīng)相互作FigureS3?C1）。在早期發(fā)育中（<12 PCW），研究人員發(fā)現(xiàn)了近端上皮干樣祖細(xì)胞群，該細(xì)胞群發(fā)展為早期腸上皮細(xì)胞。這些細(xì)胞表現(xiàn)出許多原始功能，包括在中胚層分化重要的VTN基因高表達(dá)，與ISCs相比，LGR5表達(dá)較少，和ONECUT2表達(dá)參與上皮發(fā)育（Figure 3B和FigureS3?D）。這些細(xì)胞在SI中特異表達(dá)TF GATA4(Figure3Ei)， SI是一種小鼠早期內(nèi)胚層調(diào)節(jié)因子，在12 PCW后，其表達(dá)大部分丟失這些細(xì)胞高表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白(TF)( Figure3B和3F)，證實(shí)了鐵代謝在絨毛形成中的重要性。LGR5是一種典型的ISC基因，在妊娠早期(<12 PCW)的近端/遠(yuǎn)端廣泛檢測(cè)到低水平ISCs和干樣祖細(xì)胞（Figure3B和FigureS3D）。原位雜交（ISH）證實(shí)了在10PCW處彌漫的LGR5表達(dá)，后來定位于隱窩堿基（Figure3G），類似于在雞和小鼠發(fā)育中報(bào)道的Lgr5的行為。即使在隱窩形態(tài)建立之后（如19 PCW之后），ISC仍分別構(gòu)成遠(yuǎn)端/近端樣本中捕獲的上皮細(xì)胞的18％–22％（Figure3C），高于成人結(jié)腸的scRNA-seq研究捕獲的3%-4%。與此相符，研究人員發(fā)現(xiàn)ASCL2?TF模塊（包括下游目標(biāo)LGR5）隨著發(fā)育時(shí)間的增加而顯著增加（Figure3H）。

分泌型譜系細(xì)胞在12 PCW時(shí)出現(xiàn)，在8-10 PCW時(shí)檢測(cè)到很少的杯狀細(xì)胞。然而，12 PCW后的杯狀細(xì)胞和EEC逐漸增加，反映出持續(xù)的成熟（Figure3A和S3E）。分泌細(xì)胞進(jìn)一步細(xì)分為11個(gè)簇，反映了不同的EEC亞型（A/M，D和腸嗜鉻/I/L/N細(xì)胞）以及SI特異性Paneth細(xì)胞，杯狀細(xì)胞和NEUROG3?+祖細(xì)胞群（FigureS3?F;TableS1）。與其他EEC亞型不同的是，較早檢測(cè)到Paneth細(xì)胞旁邊的I細(xì)胞和A細(xì)胞（FigureS3F）。RL映射建立了核心EEC信號(hào)通路，如腸嗜chromaffin細(xì)胞，常見于結(jié)腸12pcw，通過多種途徑與抑制性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元相互作用，包括TPH1-HTR2B，一種已知的食欲/運(yùn)動(dòng)中的5 -羥色胺信號(hào)通路(Figure S3Cii)。因此，隨著隱窩的形成，EEC多樣性和相關(guān)網(wǎng)絡(luò)在很大程度上得以建立。

相比之下，BEST4/OTOP2細(xì)胞在隱窩形成之前的時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄水平已經(jīng)不同(Figure 3I)，并且隨著時(shí)間的推移頻率沒有變化(Figure S3Gi)，這表明它們的發(fā)育可能與正常的隱窩-絨毛回路無關(guān)。此外，RL分析預(yù)測(cè)BEST4/OTOP2與神經(jīng)元細(xì)胞之間有很強(qiáng)的相互作用(同樣在發(fā)育早期建立);例如，抑制性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元表達(dá)神經(jīng)遞質(zhì)VIP，通過受體VIPR1的表達(dá)介導(dǎo)分泌BEST4 / OTOP2細(xì)胞(Figure S3Gii)。

腸道發(fā)育需要三種胚層細(xì)胞類型之間的√確相互作用。研究人員鑒定了8個(gè)部分的78個(gè)非上皮細(xì)胞簇，根據(jù)它們的轉(zhuǎn)錄、時(shí)間和位置分類(16個(gè)成纖維細(xì)胞，4個(gè)肌成纖維細(xì)胞，2個(gè)間皮細(xì)胞，12個(gè)上皮細(xì)胞，8個(gè)周細(xì)胞，13個(gè)神經(jīng)細(xì)胞，12個(gè)免疫細(xì)胞，11個(gè)肌肉細(xì)胞) (TableS1)。在這些細(xì)胞中，觀察到協(xié)調(diào)的分化動(dòng)態(tài)，一些群體首先發(fā)生變化，從而可能建立關(guān)鍵的生態(tài)位，為其他細(xì)胞鋪平道路，而在其他細(xì)胞群中，共定位群體則同步進(jìn)化。

轉(zhuǎn)錄標(biāo)簽通常對(duì)應(yīng)于結(jié)構(gòu)特征。在EC中可以清楚地看到這一點(diǎn)，將EC分為靜脈，動(dòng)脈和淋巴管類型，并通過血管大小進(jìn)一步區(qū)分（Figure4?A；TableS1）。在發(fā)育過程中，觀察到了從小血管到大血管的過渡，反映了腸道血管生成（Figure S4?A）。確定了驅(qū)動(dòng)這種變化的TF網(wǎng)絡(luò)，例如動(dòng)靜脈分化器HEY1和SOX13。成年ST的脈管系統(tǒng)很容易識(shí)別成年EC和胎兒EC信號(hào)（Figure S4?B）。與EC相對(duì)的，周細(xì)胞亞型由血管生成驅(qū)動(dòng)因子（PRRX1，THBS4和ANGPT2）定義（Figure 4?B；table S1）。ANGPT2是EC-周細(xì)胞RL相互作用的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，已證實(shí)其位于胎兒脈管系統(tǒng)中（Figure S4C）。盡管EC隔室與8 PCW處存在的大血管細(xì)胞截然不同，但周細(xì)胞種群顯示出發(fā)育滯后。為了了解這些分化動(dòng)力學(xué)，研究人員將G2M和S期周細(xì)胞與G1期細(xì)胞進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)在較早時(shí)間點(diǎn)的大多數(shù)細(xì)胞是高度循環(huán)的祖細(xì)胞（Figure S4?D）。這些種群與成纖維細(xì)胞和原始的ACTA2?+細(xì)胞共享轉(zhuǎn)錄特征，這一結(jié)果受到軌跡分析的支持（Figure S4?E）。綜上所述，提出了早期成纖維細(xì)胞向周細(xì)胞的轉(zhuǎn)變，然后是來自未成熟WNT6表達(dá)細(xì)胞的第二波周細(xì)胞增殖-分化。16 PCW時(shí)，成熟的成肌纖維細(xì)胞表現(xiàn)出相似的發(fā)育滯后（Figure 4?Ci；table S1）。文獻(xiàn)表明腸道成肌纖維細(xì)胞可能來自多種來源，并且圖形抽象顯示成熟的成肌纖維細(xì)胞類似于肌肉細(xì)胞，在特定基因（例如RSPO2，F(xiàn)igure 4?Cii）中存在明顯差異。然而，肌成纖維細(xì)胞祖細(xì)胞卻表現(xiàn)出來自成纖維細(xì)胞和周細(xì)胞的梯度譜;在19 PCW的ST中，它們占據(jù)了與過渡間質(zhì)細(xì)胞相鄰和重疊的層。（Figure 4?D和S4?E）。

與PCW7-8晚期發(fā)展出現(xiàn)的細(xì)胞類型相反，腸神經(jīng)嵴來源的細(xì)胞沿胃腸道的長(zhǎng)度遷移，進(jìn)入包含神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的粘膜下和肌間神經(jīng)叢。本研究的時(shí)間點(diǎn)（Figure4E）確定了不同的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)祖細(xì)胞，并捕獲了5個(gè)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和7個(gè)神經(jīng)元簇（FigureS5 Ai；tableS1）。除了RL分析突出的不同ENS通路（圖S3C），同時(shí)還表明ENS與其他部分相比相對(duì)成熟。在ST中，ENS成分也被清楚地看作是肌間神經(jīng)（FigureS5 Aii）。

在成年腸道中，神經(jīng)元叢被肌肉包圍。祖細(xì)胞和分化的腸平滑肌細(xì)胞（iSMCs）分別由PLPP2和ACTA2等基因標(biāo)記（Figure4 F;TableS1）。本研究確定了11個(gè)與iSMC相關(guān)的簇，包括PDGFRA +間隙細(xì)胞和Cajal間隙細(xì)胞的早期種群（FigureS5 B）。通過10 PCW觀察到內(nèi)（IM）和外（OM）肌肉的形成。這些層在胎兒腸中的發(fā)育順序尚不清楚，有相互矛盾的報(bào)道表明兩者同時(shí)發(fā)育或IM首先發(fā)育。與前者一致，觀察到分化浪潮，結(jié)腸肌層滯后于較成熟的近端組織，早期樣品以祖細(xì)胞為主，而分化的遠(yuǎn)端肌層粘膜（MM），OM和IM細(xì)胞在12歲后大量出現(xiàn)PCW（FigureS5 C）。在19 PCW處而非12 PCW處的結(jié)腸ST中，肌肉層是分開的并且在視覺上是不同的（FigureS5D）。確定了描繪肌細(xì)胞的關(guān)鍵TF網(wǎng)絡(luò)。KLF7在肌肉中，TWIST2在間質(zhì)細(xì)胞和OM細(xì)胞中（FigureS5E）。FOXF2在IM中具有特異性活性（Figure4F），這與前期的小鼠相關(guān)報(bào)道一致。此外，據(jù)報(bào)道，F(xiàn)oxf2 -/-小鼠胚胎致死，伴隨有薄壁結(jié)腸，腸神經(jīng)元數(shù)量減少，扁平的上皮細(xì)胞和未發(fā)育的成纖維細(xì)胞。這一發(fā)現(xiàn)與平滑肌介導(dǎo)的機(jī)械力是引發(fā)絨毛形成的可能性相吻合。

發(fā)育中腸道內(nèi)不同的室間由間充質(zhì)細(xì)胞支撐，間充質(zhì)細(xì)胞是腸內(nèi)*大的室間（24,081個(gè)細(xì)胞）?；诔扇藄cRNA-seq中建立的命名法將成纖維細(xì)胞命名為stromal-1-4 (S1-S4)亞型。根據(jù)時(shí)間，位置和周期的差異進(jìn)一步將它們細(xì)分為16個(gè)類（Figure 4 G；Table S1；STAR方法）。S1細(xì)胞的3個(gè)簇形成了黏膜下層結(jié)構(gòu)細(xì)胞的主體，而S2細(xì)胞（由F3，NPY和FOXL1標(biāo)記）表達(dá)的標(biāo)志物與隱窩周圍的細(xì)胞群相似，對(duì)上皮的發(fā)育和形成至關(guān)重要（Figure S6 A）。與成人相比，S3-like細(xì)胞不僅在子宮內(nèi)形成了一個(gè)主要的成纖維細(xì)胞群，而且表現(xiàn)出更大的異質(zhì)性。一些S3簇具有高表達(dá)的原始標(biāo)記(HAND1、WNT4和DLK1)，以及成人標(biāo)記S3基因(C7和CCDC80)。軌跡分析確定了一個(gè)分支點(diǎn)，未成熟的S3-like細(xì)胞分裂為S3或S1/2/4譜系，這些譜系可以被譜系特異性的TF網(wǎng)絡(luò)(如NR2F1)分化，NR2F1也在肌成纖維細(xì)胞中表達(dá)。研究人員發(fā)現(xiàn)S3-like祖細(xì)胞在增殖室中高度富集，表明這些細(xì)胞可能在這一時(shí)期產(chǎn)生大量分化成纖維細(xì)胞。

為了更好地理解S3亞型功能，研究人員研究了RL互作，注意到與EC的大量串?dāng)_預(yù)測(cè)（FigureS6D）。其中許多是通過調(diào)節(jié)結(jié)腸成纖維細(xì)胞中組織纖溶酶原激活受體LRP1介導(dǎo)的。為了在ST數(shù)據(jù)中證實(shí)這一點(diǎn)，研究人員進(jìn)行了RL空間共表達(dá)分析，該分析確定了在空間上對(duì)隱窩頂部進(jìn)行強(qiáng)空間共定位的RL對(duì)，例如CEACAM1和CEACAM5（FigureS6Ei）。在成人和胎兒組織中觀察到LRP1與血管外基質(zhì)的關(guān)鍵成分HSPG2配體的顯著共定位(p = 2.17×10^-112和p = 2.37×10^-29（成人）；p = 2.9×10^-19和 p = 0.005（12 PCW) (Figure S6Eii和S6Eiii)。在胎兒ST中，研究人員將S3簇定位于與EC相關(guān)的深度和區(qū)域（Figure4Hi），將幾種S3特異性基因（如FigureC7）的表達(dá)定位于成年組織中與脈管結(jié)構(gòu)相鄰的斑點(diǎn)，因?yàn)檫@些結(jié)構(gòu)比胎兒切片更清晰可見（Figure4Hii）。將胎兒細(xì)胞類型標(biāo)簽轉(zhuǎn)移到成人ST上，發(fā)現(xiàn)S3 HAND1 +和S3 EBF +細(xì)胞的成年配對(duì)體聚集在大血管周圍(Figure4Hiii–4Hiv)，突顯了這些細(xì)胞在形成腸血管支持位支持生態(tài)位中發(fā)揮的作用，已通過成對(duì)細(xì)胞類型信號(hào)相關(guān)性分析證實(shí)，其中EC，周細(xì)胞和“S3”型成纖維細(xì)胞信號(hào)在同一ST點(diǎn)內(nèi)相關(guān)（Figure 2Ci）。

理解腸道發(fā)育的基本問題是局部形態(tài)發(fā)生梯度及其拮抗劑是如何塑造腸絨毛形態(tài)發(fā)生的。研究人員創(chuàng)建了一個(gè)涉及8條途徑的基因形態(tài)發(fā)生圖，用以闡明這些分子在空間和時(shí)間上的作用。利用共表達(dá)分析確定了11種細(xì)胞類型特異性和13種空間共定位的形態(tài)發(fā)生模塊，在所有ST中對(duì)模塊活性進(jìn)行了評(píng)分（Figure5A和S7?A）。這些模塊通常與ST中的組織深度對(duì)齊，空間模塊3由來自EC、成纖維細(xì)胞和周細(xì)胞起源的形態(tài)發(fā)生子組成，包括LRP1，并且在組織深處（Figure5?Bi）。上皮特異性模塊表達(dá)了Hedgehog通路（IHH）的基因，例如在Wnt信號(hào)中起重要作用的卷曲的共受體LRP5，并位于管腔附近（Figure5?Bii）。另一個(gè)含有肌纖維母細(xì)胞成分的細(xì)胞，具有形態(tài)發(fā)生原WNT2B和受體RSPO2，在12PCW時(shí)出現(xiàn)彌漫性，并在以后逐漸定位（FigureS7?B）。這與發(fā)現(xiàn)成熟的成肌纖維細(xì)胞在上皮成分后出現(xiàn)的發(fā)現(xiàn)一致，表明ISC-成纖維細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)回路直到隱窩形成后才建立。WNT2B由間皮表達(dá)，在成肌纖維細(xì)胞分化之前提供了配體的唯一來源（FigureS7B）。類似地，RSPO3，其可以用信號(hào)通知經(jīng)由ISC的LGR5（FigureS7Ci）在間皮/肌層模塊中很高，主要在12 PCW之前見到，然后隨著時(shí)間的流逝隨著組織深度的增加而消失（Figure5C）。這表明，隨著腸的生長(zhǎng)，原本可能因?qū)娱g物理距離的增加而被打破的形態(tài)梯度，可以通過依次發(fā)育的細(xì)胞類型的表達(dá)而恢復(fù)。

周圍隱膜S2成纖維細(xì)胞或端粒細(xì)胞通過表達(dá)生長(zhǎng)因子β（TGF-β）超家族配體和WNT通路來提供上皮支持。從TGF-β（BMP2，BMP4和BMP5）和非典型WNT通路（WNT5A和WNT5B）（Figure S6 A）。這些S2特異性基因形成了一個(gè)主要的粘膜下成纖維細(xì)胞形態(tài)發(fā)生模塊（scRNA-seq模塊2），該模塊包含DLL1，BMP5和NRG1（Figure 5 D）。連同RL相互作用（例如DLL1 – NOTCH2（Figure S7 Cii））一起，這突出顯示了S2細(xì)胞及其提供的富含形態(tài)原的利基在上皮細(xì)胞形成中的重要性。與其他成纖維細(xì)胞種群不同，TI和結(jié)腸S2細(xì)胞不同，有885個(gè)差異表達(dá)基因（<5％FDR）（FigureS7 D），包括POSTN或TI突出的PDGFRA的結(jié)腸特異性表達(dá)（Figure S7 D）。在10 PCW之前發(fā)現(xiàn)許多位置差異，這表示在隱窩/絨毛形式之前具有很強(qiáng)的位置同一性-例如POSTN和BMP3在它們各自的S2亞型中很早就被發(fā)現(xiàn)（Figure 5 E）。S2形態(tài)發(fā)生譜中的關(guān)鍵位置差異提示了一種機(jī)制，通過該機(jī)制可以發(fā)展出極大不同的上皮形態(tài)。

最后，研究人員證實(shí)S2標(biāo)記F3在隱窩形成之前就已經(jīng)存在，并且形成的小丘隨著絨毛的形成而逐漸增加（Figure 5 F）。因此，在人腸道中，S2型纖維母細(xì)胞不僅是維持上皮隱窩位所必需的，而且可能在其形成中發(fā)揮積極作用。

人類腸道免疫力的發(fā)展

該研究中得到的圖譜捕獲了發(fā)育過程中來自6個(gè)譜系(巨噬細(xì)胞，單核細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞，適應(yīng)性和先天淋巴細(xì)胞)的2199個(gè)免疫細(xì)胞（Firgure6A和6B；Table S1；STAR methods）。免疫細(xì)胞在SI中（占捕獲的所有細(xì)胞的3％–8％）比結(jié)腸（平均占1％– 2.5％）更為普遍，總體而言在孕早期之前尤其罕見。在10 PCW之前，研究人員觀察到了髓樣細(xì)胞富集（Figure S8 A），而在12 PCW時(shí)，涌入了大量的幼稚CD4⁺和CD8⁺T細(xì)胞，自然殺傷細(xì)胞（NK），1型先天性淋巴樣細(xì)胞（ILC），以及3型ILC（Firgure 6C）。后者在胎兒腸道中的患病率比成人高得多，在某些晚期樣本中占所有捕獲的免疫細(xì)胞的30％。

胎兒ILC3表達(dá)IL7RA和ID2（TableS1），這對(duì)小鼠子宮Peyer’s斑塊（PPs）的形成至關(guān)重要，因此將這些細(xì)胞區(qū)分為3型淋巴組織誘導(dǎo)劑（LTi）。PP的形成是一個(gè)LTi細(xì)胞、EC和基質(zhì)細(xì)胞之間相互協(xié)調(diào)作用的過程。此外，鼠類研究顯示其還需要RET/ARTN/GFRA3神經(jīng)軸，而GFRA3缺乏會(huì)導(dǎo)致PP發(fā)育受損。腸道相關(guān)淋巴樣組織（GALT）的形成被認(rèn)為在出生前以PPs的形式出現(xiàn)在SI體內(nèi)，而在出生后以結(jié)腸的形式出現(xiàn)。相反，在此，研究人員確定了一個(gè)獨(dú)特的結(jié)腸而不是SI特異的神經(jīng)膠質(zhì)種群，它是發(fā)育過程中唯一的GFRA3來源，并在15 PCW時(shí)擴(kuò)展（Figure6 D），表明在人類結(jié)腸發(fā)育過程中可能存在類似的神經(jīng)免疫回路。

PP形成的其他關(guān)鍵介質(zhì)包括通過CCL19，CCL21和CXCL13促進(jìn)LTi組織歸巢的基質(zhì)組織細(xì)胞。研究人員發(fā)現(xiàn)這些特異性地定位于兩個(gè)S4成纖維細(xì)胞簇，并且表達(dá)隨著發(fā)育而增加（Figure6B和6E）。在S4簇中繪制RL相互作用的圖譜突出顯示了與各種免疫細(xì)胞的串?dāng)_，包括通過VCAM1 – ITGB7的ILC3信號(hào)傳遞（FigureS8 B）。這進(jìn)一步支持了S4在淋巴樣組織形成中的作用-這些粘附分子是GALT形成所必需的。LTi細(xì)胞和S4細(xì)胞還表現(xiàn)出通過IL7和CCL19/21與它們的受體IL7R/CCR7的相互作用（FigureS8C），如果小鼠中不存在，則會(huì)導(dǎo)致無法形成次級(jí)淋巴濾泡。

為了在空間上確認(rèn)這些相互作用，研究人員研究了成人ST，其中粘膜下淋巴濾泡被視為獨(dú)特的結(jié)構(gòu)。S4和免疫細(xì)胞（例如CD3和CD19）的關(guān)鍵標(biāo)記基因在這些卵泡中和周圍表達(dá)，因子分析證實(shí)了各種成年免疫細(xì)胞（B細(xì)胞，T細(xì)胞和髓樣細(xì)胞）和此處定位的S4細(xì)胞類型（Figure6） F）。研究人員還發(fā)現(xiàn)ST中關(guān)鍵RL對(duì)的顯著共定位（包括CCR7 / CC19（1個(gè)點(diǎn)內(nèi)p = 1.098×10 -10，半徑內(nèi)p = 5.59×10 -49）（Figure6G）。表明S4細(xì)胞是成年結(jié)腸中與卵泡相鄰的成纖維細(xì)胞，在胎兒GALT發(fā)育過程中以時(shí)間依賴性方式出現(xiàn)。

兩個(gè)S4簇在很大程度上都是SI特異的，維持PP的子宮發(fā)育，但不維持結(jié)腸GALT，并且在12 PCW之前完全不存在（FigureS8 D）。比較這兩個(gè)種群的轉(zhuǎn)錄譜，發(fā)現(xiàn)S4 CXCL13 +亞型表現(xiàn)出許多隱性S2成纖維細(xì)胞的關(guān)鍵特征（POSTN，F(xiàn)3，PDGFRA和BMP5），并且是RANKL/TNFSF11的唯一腸道來源（FigureS8E）-其缺陷導(dǎo)致PP形成受損，并且是PP中M細(xì)胞分化所必需的。綜上，PP中相同的隱周成纖維細(xì)胞起著上皮隱窩位支持細(xì)胞，淋巴組織形成的協(xié)調(diào)者和間質(zhì)免疫串?dāng)_介體的作用，從而揭示了它們迄今未曾意識(shí)到的高度動(dòng)態(tài)的作用。

該研究在時(shí)間方面允許研究隨著發(fā)育時(shí)間而變化的疾病基因（Figure7D），并可以提供與時(shí)間相關(guān)的信息，突出顯示PCW前12膠質(zhì)細(xì)胞和IM祖細(xì)胞表達(dá)的基因HMGA2（分別為FDR<2.2e-16）（Figure7Ei），與腸道旋轉(zhuǎn)不良有關(guān)（12q14微缺失綜合癥，ORPHA：94063）。同樣，早期抑制運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元特異的NXN的致病變體（Figure7Eii）會(huì)導(dǎo)致卵泡擴(kuò)張（Robinow綜合征，OMIM：618529）。在此發(fā)育時(shí)期，腸子回到了腹部，表明ENS細(xì)胞和肌肉祖細(xì)胞可能對(duì)該過程至關(guān)重要。

總結(jié)