染色質免疫共沉淀測序技術（Chromatin Immunopreciptation with Sequencing，ChIP-Seq），作為傳統的研究細胞內蛋白質與DNA互作的重要工具，技術成熟，已被廣泛應用于動植物的表觀遺傳學研究。但是由于ChIP的交聯作用/免疫共沉淀的局限性（如：需要大量細胞，實驗重復性差，低信號、高背景等），往往導致大量的精力投入卻得不到預期的結果。CUT&Tag解除了傳統ChIP-Seq的眾多限制因素，勢必將引領蛋白質—DNA互作新革命。
CUT&Tag（Cleavage Under Targets and Tagmentation）技術首次應用于哺乳動物細胞，并于2019年4月29日《Nature Communications》上公布[1]。
什么是CUT&Tag？
CUT&Tag是一種全新的研究DNA與蛋白質互作的技術，可以替代傳統的ChIP-Seq，主要用于研究目標蛋白在染色質上的定位，在表觀遺傳學研究等領域至關重要。
圖1 CUT&Tag的基本原理
CUT&Tag使用Protein A與Tn5轉座酶的融合蛋白（ChiTag），在抗體的引導下，Protein A與染色質上的目的組蛋白修飾標記、轉錄因子或染色質調控蛋白結合，連帶的Tn5轉座酶對目的蛋白附近的DNA序列進行切割，并將測序接頭連接到切割片段的兩端（圖1），并釋放到細胞外，PCR擴增后直接用于高通量測序。
與ChIP-Seq相比，CUT&Tag具有哪些優(yōu)勢？
圖2 CUT&Tag與ChIP-Seq實驗流程對比[2]
（1）無需交聯、超聲打斷等步驟，節(jié)約時間；
（2）不受ChIP交聯引起的表位遮蔽影響；
（3）高分辨率和低背景信號（這是由于轉座酶原位激活切割染色質）；（4）轉座酶切割片段兩邊序列能同時加上測序接頭，為PCR擴增做準備；
（5）細胞需求量從10,000個降至60個甚至單細胞；
（6）需要的測序深度低，節(jié)省成本。
CUT&Tag在植物上很難成功？
植物細胞細胞壁、大液泡及一些次生代謝產物的存在，使得這項技術在植物中的應用多具挑戰(zhàn)性。但是，Tao等于2020年8月31日在《Plant Methods》上發(fā)表CUT&Tag和ChIP-Seq技術在棉花應用的比較[2]，種種結果表明，CUT&Tag技術能夠在植物中成功應用，且所得結果明顯優(yōu)于ChIP-Seq。
H3K4me3是一個通用的基因表達活性標記。Tao等用棉花葉片為材料，以H3K4me3抗體設置了2個生物學重復，以IgG抗體作為對照用于CUT&Tag實驗；用H3K4me3抗體做一個ChIP，不加H3K4me3抗體的ChIP mock作為對照。分別從以下幾點對CUT&Tag和ChIP-Seq進行比較。
一、 重復性
對CUT&Tag和ChIP數據進行相關性分析，發(fā)現CUT&Tag的兩個生物學重復（CUT&Tag_H3K4me3_rep1和CUT&Tag_H3K4me3_rep2）與對照CUT&Tag_IgG相關性非常低（r=0.01，Pearson’s correlation），表明CUT&Tag實驗組和對照組（背景噪音）存在顯著性差異（圖3，a），然而，ChIP_H3K4me3實驗組與ChIP_mock具有很高的相關性（r=0.89，Pearson’s correlation），這表明，ChIP分析中信號-噪音比例很高（圖3，a），而CUT&Tag實驗組的兩個生物學重復相關性近乎完美（r=0.97，Pearson’s correlation），說明不同的生物學重復之間重復性非常好（圖3，b）。
圖3 CUT&Tag與ChIP樣品的相關性分析。
二、分辨率（測序深度）
為了分析CUT&Tag和ChIP的數據的信號分辨率，每個樣品隨機選取6M-24M的clean data，分別call peak后發(fā)現CUT&Tag實驗組的兩個生物學重復在clean data為6M時，peaks數目分別為42,367和46,779，ChIP僅有18,024條，當ChIP的 clean data達到24M時，peaks數才達到40,859條（表1），這意味著CUT&Tag 6M clean data產生的信號分辨率相當于ChIP 24M clean data產生的。這些peaks中的25,597（54.7-62.6%）個是CUT&Tag與ChIP共有的，兩個CUT&Tag生物學重復的共有peaks為37,168（79.5-87.7%；圖3，c），這也說明CUT&Tag的高重現性。
表1 相同測序深度下CUT&Tag及ChIP產生的 peaks數及FRiP值
三、 信噪比
FRiP（fraction of reads in peaks）values calculated the ratio of mapped reads that fall into peaks among all mapped reads. FRiP值越高，信噪比越高，結果也越可靠。結果表明CUT&Tag產生的信噪比較高（FRiP=0.7；表1）。然而，從H3K4me3信號熱圖上可以看出，在整個gene body區(qū)域CUT&Tag的信號比ChIP-Seq更強（圖4，a）。從相關性分析的結果可以看出，基因附近的peaks在CUT&Tag兩個生物學重復之間相關性很高（r=0.94，pearson’s correlation；圖4，b），CUT&Tag和ChIP之間的相關性也較高（r=0.71，pearson’s correlation；圖4，c）。
圖4 CUT&Tag和ChIP分析蛋白質編碼基因附近的H3K4me3信號
四、靈敏性
與熱圖顯示的強度一致，IGV截圖表明CUT&Tag信號在分辨率和靈敏度上的表現優(yōu)于ChIP（圖5，a），尤其在表達量相對低的基因中表現尤為明顯（如GB_A11G1394, GB_D10G1774, 和 GB_A13G1872；圖5，b）
圖5 有代表性的H3K4me4信號的IGV截圖
綜上所述，Tao等對Steven Henikoff團隊研發(fā)的CUT&Tag技術進行改進，打破植物細胞壁、大液泡和次生代謝產物的壁壘，使其能夠廣泛應用于植物染色質的釋放。CUT&Tag與傳統的ChIP-Seq相比，操作簡單，所需時間短，且所需細胞少，能產生高分辨率信號，且背景噪音低，這些優(yōu)點奠定了不久的將來該技術在表觀遺傳學研究中的“流量新秀”的地位。
參考文獻：
京公網安備 11011302003368號