眾所周知，要獲得基因組的完整圖片，就必須組裝reads，以目前主要的測(cè)序技術(shù)來(lái)看，短讀長(zhǎng)測(cè)序提供了很高的z確性，但僅提供了少量數(shù)據(jù)片段，從而只能得到不完整的圖片；而傳統(tǒng)的長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序，可提供更大的圖像，但缺乏z確性，因此很難分辨出真實(shí)的生物學(xué)變異與測(cè)序錯(cuò)誤之間的區(qū)別。然而，兼顧長(zhǎng)讀長(zhǎng)與高精度的HiFi測(cè)序正在改變一切，今天我們就來(lái)聊聊HiFi測(cè)序以及百邁客PacBio SequelⅡ平臺(tái)HiFi產(chǎn)出情況吧。
一、何為 HiFi測(cè)序
HiFi reads（High Fidelity reads）是2019年由PacBio推出的基于環(huán)化共有序列（Circular Consensus Sequencing，CCS）模式產(chǎn)生的既兼顧長(zhǎng)讀長(zhǎng)（10-20kb的長(zhǎng)度）又具有高精度（>99%z確率）的測(cè)序結(jié)果。
在CCS測(cè)序模式下（圖1），酶讀長(zhǎng)遠(yuǎn)大于插入片段長(zhǎng)度，聚合酶會(huì)繞著模板進(jìn)行滾環(huán)測(cè)序，插入片段會(huì)被多次測(cè)序。單次測(cè)序中產(chǎn)生的隨機(jī)測(cè)序錯(cuò)誤，通過(guò)環(huán)形測(cè)序生成的一系列Subreads來(lái)進(jìn)行自我打磨，通過(guò)算法進(jìn)行自我糾錯(cuò)校正，最終得到高z確度的HiFi reads。
圖1 HiFi reads是如何生成的
二、SMRTbell文庫(kù)的構(gòu)建流程簡(jiǎn)述
1.SMRTbell文庫(kù)的結(jié)構(gòu)
bell即“鈴”的意思，如圖2，構(gòu)建完成的bell文庫(kù)形狀就如同一個(gè)啞鈴。其主要組成部分是：發(fā)卡狀的接頭（Hairpin Adapter）和雙鏈DNA模板（Double Stranded DNA Template）。而文構(gòu)建完成后、測(cè)序前還需要完成bell文庫(kù)、Sequencing Primer、DNA Polymerase的混合工作（測(cè)序引物退火結(jié)合bell文庫(kù)，然后引物-bell文庫(kù)復(fù)合物結(jié)合DNA聚合酶）。最終產(chǎn)物如圖3所示。
2.SMRTbell文庫(kù)構(gòu)建流程
以基因組HiFi文庫(kù)為例（15-20K文庫(kù)）（圖4）。當(dāng)?shù)玫絞DNA后，先利用G-tube管或Megaruptor System將基因組片段化至合適大小，而后通過(guò)去除單鏈懸突、損傷修復(fù)和末端修復(fù)等步驟，得到完整的雙鏈插入片段。接下來(lái)，通過(guò)將接頭連接至雙鏈DNA來(lái)創(chuàng)建SMRTbell文庫(kù)，從而得到環(huán)狀模板。完成接頭連接后，需要對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行純化，利用酶處理（圖5）來(lái)消化線性或內(nèi)部損傷環(huán)形DNA分子（游離的Hairpin Adapter、兩端未連接Adapter的DNA模板、已成環(huán)但內(nèi)部有損傷的DNA模板），酶處理完畢后，一般會(huì)利用Bulepippin或Sage ELF System切膠回收目標(biāo)大小范圍內(nèi)的文庫(kù)。
圖5 酶處理示意圖
三、HiFi測(cè)序的性能
1.使用HiFi Reads 進(jìn)行基因組De Novo組裝的能力
在基因組從頭組裝方面，研究者利用HiFi reads應(yīng)用FALCON、Canu和wtdbg2算法分別對(duì)HG002基因組進(jìn)行了從頭組裝，結(jié)果顯示組裝質(zhì)量均較高，contigN50超過(guò)15Mb，并且與HG002標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果高度一致，吻合率達(dá)到99.9983%（Q47.7）[1]。
表1 不同測(cè)序技術(shù)及分析流程組裝結(jié)果
2.使用HiFi測(cè)序檢測(cè)人類基因組變異的能力
基因組測(cè)序中重要的自然是z確率，只有保證較高的z確率，基因組的研究才有價(jià)值。下圖展示了最近的PrecisionFDA 真實(shí)挑戰(zhàn)賽V2的結(jié)果（圖6），在單一技術(shù)參賽結(jié)果中，使用PacBio HiFi數(shù)據(jù)（粉紅色）在所有類別中，無(wú)論是全基因組范圍（“所有基準(zhǔn)區(qū)域”），還是在難以映射的區(qū)域或是主要的組織相容性復(fù)合體（MHC）中均提供了較高的z確性。所有的多技術(shù)參賽結(jié)果（橙色）中都使用了PacBio HiFi數(shù)據(jù)[2]。
圖6 PrecisionFDA Truth Challenge V2結(jié)果
另外，由下圖可以看出（圖7），Google DeepVariant使用HiFi數(shù)據(jù)提交的結(jié)果在所有單一技術(shù)檢測(cè)全基因組范圍內(nèi)的變異z確性*高，對(duì)SNV√確度和召回率可以達(dá)到99.9%，對(duì)插入缺失的√確度和召回率可以達(dá)到99.4%[2]。
圖7 不同測(cè)序技術(shù)及分析流程結(jié)果對(duì)比
四、百邁客HiFi測(cè)序數(shù)據(jù)展示
百邁客自2019年引進(jìn)PacBio SequelⅡ平臺(tái)以來(lái)，在HiFi測(cè)序方面已經(jīng)積累了大量的經(jīng)驗(yàn)，在技術(shù)人員的不斷優(yōu)化下，HiFi文庫(kù)單cell產(chǎn)出更是有了新的突破，下面跟大家分享一下部分HiFi文庫(kù)產(chǎn)出情況（表2）。在統(tǒng)計(jì)近1個(gè)月的HiFi cell中，我們單cell平均產(chǎn)出達(dá)416Gb。其中，單cell產(chǎn)出達(dá)400 Gb以上的占比達(dá)68%，同時(shí)，單cell的HiFi reads數(shù)據(jù)量高達(dá)32 Gb，占原始產(chǎn)出的比例*高可達(dá)7.96%。在讀長(zhǎng)方面，平均酶讀長(zhǎng)已超70Kb，HiFi reads長(zhǎng)達(dá)18Kb。
表2 百邁客部分HiFi文庫(kù)下機(jī)數(shù)據(jù)產(chǎn)出統(tǒng)計(jì)表
HiFi數(shù)據(jù)由于其長(zhǎng)讀長(zhǎng)和高z確性，結(jié)合針對(duì)HiFi reads開發(fā)的組裝軟件，在基因組組裝上有著較大優(yōu)勢(shì)。一般物種，單套30×CCS數(shù)據(jù)即可滿足基因組組裝需求，且無(wú)需繁瑣的糾錯(cuò)過(guò)程，縮短組裝時(shí)間，并能夠識(shí)別復(fù)雜基因組區(qū)域的細(xì)微差別，有助于增加基因組組裝的連續(xù)性、z確性和完整性。
在基因組組裝方面，HiFi測(cè)序正受到眾多科研工作者的青睞，已經(jīng)成為越來(lái)越多研究者的不二之選，百邁客自2015年國(guó)內(nèi)引進(jìn)PacBio三代測(cè)序平臺(tái)以來(lái)，在基因組研究領(lǐng)域已經(jīng)有近百余篇合作文章發(fā)表于世界知名期刊，累計(jì)影響因子600+，目前已經(jīng)擁有成熟的從測(cè)序到分析的完整HiFi流程，歡迎各位老師前來(lái)咨詢！
參考文獻(xiàn)
[1]Wenger A M , Peluso P , Rowell W J , et al. Accurate circular consensus long-read sequencing improves variant detection and assembly of a human genome[J]. Nature Biotechnology, 2019, 37(11).
[2]PacBio.In precisionFDA Challenge,PacBio HiFi Reads Outperform Both Short Reads and Noisy Long Reads.https://www.pacb.com/blog/precisionfda-challenge/[EB/OL].2020.08.11
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