每個(gè)人的衣櫥的里面都會(huì)有一件白色的T恤，因?yàn)榘俅?。其?shí)測(cè)序界也有一件白色的T恤，小伙伴們你們猜出來(lái)了嗎？沒(méi)錯(cuò)，它就是轉(zhuǎn)錄組。轉(zhuǎn)錄組是一款比較基礎(chǔ)的測(cè)序產(chǎn)品，他可以和不同的組學(xué)進(jìn)行搭配，或是用于找關(guān)鍵的biomarker，或是用于協(xié)助解析分子機(jī)制。
今天小編就帶著大家看一篇關(guān)于的轉(zhuǎn)錄組、RNA甲基化、蛋白組聯(lián)合的文章。這篇文章中RNA甲基化是采用的MeRIP-seq二代的技術(shù)，操作相對(duì)比較復(fù)雜，現(xiàn)在已經(jīng)可以升級(jí)做ONT RNA甲基化，值得一提的是這篇文章的整體思路是可以借鑒的。
文獻(xiàn)名：m6A modification suppresses ocular melanoma through modulating HINT2?mRNA translation
期刊：Molecular Cancer（IF:15.302）
文章思路快速get ：
文章中通過(guò)RNA甲基化試劑盒的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在黑素瘤樣本中m6A甲基化水平降低，為了進(jìn)一步研究m6A甲基化在腫瘤樣本中的調(diào)控機(jī)制。采用RNA-seq、MeRIP-seq等技術(shù)找到關(guān)鍵的基因HINT2，隨后在細(xì)胞系中進(jìn)行敲除實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)細(xì)胞侵襲、凋亡等情況；同時(shí)進(jìn)行RIP-qPCR、RNA-pull down以及雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)等實(shí)驗(yàn)，揭示了m6A甲基化修飾在眼部黑色素瘤腫瘤中調(diào)控中的機(jī)制，為后續(xù)研究以及藥物治療提供了新的見(jiàn)解。? ??
研究背景
惡性黑素瘤( malignant melanoma，MM) 的發(fā)生率在常見(jiàn)腫瘤中排第 4 位，分別占男性和女性癌癥病例的 6.4%和 4.1%。約 91%的 MM 發(fā)生在皮膚上，皮膚黑素瘤( cutaneous malignant melanoma，CMM) 是最具攻擊性和致命性的皮膚腫瘤。ＲNA 甲基化是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，目前發(fā)現(xiàn)其參與了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，與免疫治療耐受的發(fā)生密切相關(guān)，其在黑素瘤中的研究也逐漸引起關(guān)注。
技術(shù)平臺(tái)
RNA-seq、MeRIP-seq、Label-free MS
研究結(jié)果
1.?黑素瘤樣本中m6A甲基化水平降低
Fig1 m6A水平降低與眼部黑色素瘤預(yù)后不良有關(guān)
為了研究m6A甲基化在眼惡性黑色素瘤中的功能作用，研究者用甲基化試劑盒先對(duì)腫瘤樣本和正常樣本做甲基化整體水平檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在腫瘤樣本中RNA甲基化的水平明顯降低（Fig. 1a）。同時(shí)通過(guò)免疫熒光實(shí)驗(yàn)和含量檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)甲基化轉(zhuǎn)移酶METTL3相對(duì)于正常的樣本來(lái)說(shuō)，有明顯的降低；而去甲基化酶（eraser）ALKBH5在則明顯高于正常組織樣本（Fig. 1b-1c）。Kaplan-Meier分析顯示METTL3低表達(dá)會(huì)增強(qiáng)腫瘤早期復(fù)發(fā)和細(xì)胞侵襲，而高表達(dá)ALKBH5則顯示預(yù)后不良。除此之外，黑色素瘤腫瘤細(xì)胞系結(jié)果也與組織樣本中的結(jié)果一致。這些數(shù)據(jù)表明，不管是組織樣本還是細(xì)胞系樣本中，黑色瘤素樣本中可以通過(guò)低表達(dá)METTL3或者高表達(dá)ALKBH5來(lái)降低m6A修飾。
為了進(jìn)一步說(shuō)明上述結(jié)論的準(zhǔn)確性，研究者在細(xì)胞系做分別對(duì)METTL3、ALKBH5進(jìn)行敲除實(shí)驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)沉默METTL3后，正常黑素細(xì)胞形成較大的集落，細(xì)胞分裂加快，凋亡減少；沉默ALKBH5，m6A甲基化顯著增加，細(xì)胞分裂減少，凋亡增加。同時(shí)轉(zhuǎn)錄組RNAseq和GSEA分析都進(jìn)一步證明在高m6A修飾的細(xì)胞系中抗腫瘤明顯，并且ALKBH5是主要靶基因簇。
2.?甲基化測(cè)序和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)ふ襪6A介導(dǎo)的潛在靶點(diǎn)
隨后對(duì)正常細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行MeRIP-seq和miCLIP-seq進(jìn)行甲基化檢測(cè)。從正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞生成的miclipo -seq文庫(kù)中，平均鑒定出13,083和11,750個(gè)m6A峰。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，m6A修飾在腫瘤細(xì)胞中廣泛重復(fù)，而正常細(xì)胞中有更多的基因只有一個(gè)m6A位點(diǎn)。同時(shí)鑒定到有5828個(gè)m6A顯著改變的基因。GO 注釋結(jié)果顯示這些基因主要富集在細(xì)胞增殖和細(xì)胞死亡。KEGG通路分析顯示在HIF-1 和 p53通路有明顯富集。并且正常細(xì)胞中含有m6A修飾的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量比腫瘤細(xì)胞高出5倍以上(Fig2a)，而這些轉(zhuǎn)錄本主要參與細(xì)胞增殖和腫瘤發(fā)生相關(guān)的幾種信號(hào)通路(Fig2b)。這些現(xiàn)象都表明m6A在腫瘤發(fā)生過(guò)程中有著重要的調(diào)控作用。
為了系統(tǒng)地闡明眼黑色素瘤中m6A修飾減少導(dǎo)致的基因表達(dá)變化，研究者結(jié)合轉(zhuǎn)錄組、蛋白定量的數(shù)據(jù)找到了237個(gè)相關(guān)的基因(Fig2c)。正如預(yù)期的那樣，這些基因存在m6A修飾，且基因mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)不一致，說(shuō)明m6A修飾可能影響轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。找到的這些基因主要還是集中細(xì)胞周期、細(xì)胞粘附和蛋白過(guò)程(Fig2d)。其中HINT2是在正常細(xì)胞中蛋白表達(dá)和m6A富集最顯著的基因之一，因此研究這選擇它作為典型例子來(lái)分析m6A修飾在腫瘤發(fā)生過(guò)程中作為翻譯調(diào)節(jié)因子的機(jī)制(Fig2e)。在miCLIP-seq數(shù)據(jù)中，發(fā)現(xiàn)3’UTR上的HINT2 mRNA中有一個(gè)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的m6A峰，在正常細(xì)胞中富集明顯(Fig2f)。為了驗(yàn)證該結(jié)論的準(zhǔn)確性，作者通過(guò)RIP-qPCR、Western blotting和qPCR驗(yàn)證了HINT2 mRNA上m6A修飾減少，HINT2蛋白表達(dá)下調(diào)，而mRNA水平無(wú)顯著變化。
Fig2 轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)識(shí)別調(diào)控腫瘤發(fā)生的m6A靶點(diǎn)
3.?HINT2依賴于m6A抑制眼部黑色素瘤
在眼黑色素瘤細(xì)胞中，在mRNA水平和蛋白水平均過(guò)表達(dá)HINT2。發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)HINT2后，眼黑色素瘤細(xì)胞的細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移、和克隆形成明顯受到抑制，細(xì)胞凋亡增加。此外，GSEA顯示在腫瘤細(xì)胞中HINT2促進(jìn)凋亡和細(xì)胞死亡(Fig3a)。為了確定HINT2在體內(nèi)腫瘤特征中的作用，過(guò)表達(dá)HINT2的眼黑色素瘤細(xì)胞進(jìn)行了皮下移植。結(jié)果顯示：相對(duì)于對(duì)照組(Fig3b, A組)來(lái)說(shuō)，實(shí)驗(yàn)組HINT2過(guò)表達(dá)組(Fig3b, B組)腫瘤體積持續(xù)降低。為了研究這些蛋白表達(dá)的變化是否在樣本中發(fā)生，在眼黑色素瘤和正常組織中進(jìn)行IF實(shí)驗(yàn)(Fig3c)，發(fā)現(xiàn)HINT2確實(shí)在腫瘤樣本中下調(diào)。除此之外，在眼黑色素瘤組織樣本中，低表達(dá)的HINT2與不良預(yù)后高度相關(guān)(Fig3e)。
由于HINT2在眼黑色素瘤中抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移，并且與正常細(xì)胞相比，腫瘤中m6A甲基化減少，推測(cè)m6A修飾降低會(huì)上調(diào)HINT2表達(dá)從而抑制腫瘤生長(zhǎng)。通過(guò)對(duì)的MeRIP的RNA片段進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)HINT2 mRNA的 3’UTR上m6A峰被METTL3特異性甲基化，和ALKBH5去甲基化。除此之外，HINT2蛋白的表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于mRNA的表達(dá)水平。隨后在腫瘤細(xì)胞系構(gòu)建敲除HINT2細(xì)胞系，結(jié)果都表明m6A引導(dǎo)的腫瘤抑制作用部分來(lái)源于HINT2的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。
Fig3?HINT2在眼黑色素瘤細(xì)胞中起抑癌基因的作用
4.?m6A修飾促進(jìn)了HINT2翻譯
??????????因?yàn)閙6A甲基化似乎促進(jìn)了HINT2的翻譯，作者假設(shè)HINT2轉(zhuǎn)錄本是YTH家族的靶點(diǎn)，YTH家族是m6A解讀器，調(diào)控m6A修飾的轉(zhuǎn)錄本的翻譯。RIP-qPCR分析顯示，HINT2 mRNA與YTHDF1的相互作用強(qiáng)于其他 mRNA(Fig4a)。此外，RNA-pull down實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)YTHDF1與HINT2 mRNA相互作用，HINT2的m6A修飾極大地促進(jìn)了其與YTHDF1的結(jié)合(Fig4b, c)。YTHDF1表達(dá)下調(diào)(Fig4d line 1)降低了HINT2 蛋白的表達(dá)(Fig4d line2)，而YTHDF1過(guò)表達(dá)(Fig4e, f line 1)增加了HINT2蛋白的表達(dá)(Fig4e- f line2)。這些HINT2表達(dá)的變化不是由于HINT2 轉(zhuǎn)錄本豐度的變化(Fig4d-f)；而是mRNA翻譯的調(diào)控依賴于轉(zhuǎn)錄本的甲基化。同時(shí)HINT2 3’UTR (WT)或m6A位點(diǎn)突變(MT)序列構(gòu)建雙熒光素酶載體，雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)也顯示，ALKBH5顯著降低了報(bào)告基因的熒光素酶活性，(Fig4g)。具體來(lái)說(shuō)，通過(guò)m6A修飾，HINT2轉(zhuǎn)錄本與積極轉(zhuǎn)錄核糖體的關(guān)聯(lián)得到了改善(Fig4h)。綜上所述，當(dāng)YTHDF1識(shí)別HINT2時(shí)，m6A修飾對(duì)其翻譯有影響。
Fig3 YTHDF1 促進(jìn) HINT2翻譯
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