【項(xiàng)目案例】黃瓜果把長(zhǎng)度遺傳變異機(jī)制研究 | 群體研究

01 黃瓜果把長(zhǎng)度的遺傳特征

授粉30天后，雙親Jin5-508和YN黃瓜果把長(zhǎng)度不再增長(zhǎng)，于是選擇該時(shí)間節(jié)點(diǎn)作為果把長(zhǎng)度鑒定的時(shí)期（圖1a）。Jin5-508果把長(zhǎng)度顯著長(zhǎng)于YN，這種差異是因?yàn)镴in5-508果把果肉細(xì)胞體積大于YN，而非細(xì)胞數(shù)增多（圖1b,c,d,e）。統(tǒng)計(jì)F₁群體、回交群體和F₂群體果把長(zhǎng)度發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)₁群體表現(xiàn)出中親表型，而回交群體表型更偏向于輪回親本，F(xiàn)₂群體表現(xiàn)出連續(xù)的近正態(tài)分布（圖1f），以上結(jié)果表明黃瓜果把長(zhǎng)度是數(shù)量性狀。

圖1?黃瓜果把長(zhǎng)度遺傳特征

02果把長(zhǎng)度QTL的初定位—BSA方法+遺傳圖譜

作者在1231個(gè)F₂群體（Jin5-508 × YN）選擇了長(zhǎng)把和短把單株各50個(gè)，構(gòu)建2個(gè)極端性狀DNA混池，對(duì)該混池及雙親進(jìn)行高通量測(cè)序及BSA分析。親本測(cè)序深度分別為34x（Jin5-508）和20x（YN），混池測(cè)序深度分別為61x和52x。測(cè)序數(shù)據(jù)與黃瓜參考基因組9930比對(duì)，2個(gè)混池分別開發(fā)了342,496和399,764個(gè)SNP，基于SNP index算法，在chr7上定位到一個(gè)主效QTLFnl7.1?(閾值0.833)，區(qū)間范圍9.98–14.61 Mb（圖2c）。

圖2?BSA定位結(jié)果

為驗(yàn)證BSA的定位結(jié)果，作者在3個(gè)不同環(huán)境下調(diào)查了102個(gè)F_2:3家系（Jin5-508 ×?YN）的表型，結(jié)果顯示F_2:3表型也符合正態(tài)分布（圖3a）。基于雙親重測(cè)序數(shù)據(jù)，作者在7號(hào)染色體上開發(fā)了72個(gè)雙親多態(tài)標(biāo)記（SNP和InDel），用這些標(biāo)記合F₂群體構(gòu)建7號(hào)染色體的連鎖圖譜。結(jié)合F_2:3群體3個(gè)環(huán)境的表型以及F₂遺傳圖譜，共同定位到了1個(gè)主效QTL（圖3b），表型貢獻(xiàn)率在27.9%-32.7%。綜合BSA定位和遺傳圖譜定位結(jié)果，最終吧QTL Fnl7.1定位在7號(hào)染色體上2.85Mb的區(qū)間內(nèi)。

圖3?F2:3群體表型變異及遺傳圖譜定位結(jié)果

03 Fnl7.1的精細(xì)定位

作者利用初定位側(cè)翼標(biāo)記InDel01和SNP01對(duì)大規(guī)模F₂單株（4000株）進(jìn)行分型，篩選得到51個(gè)區(qū)間重組單株。在InDel01和SNP01區(qū)間內(nèi)又開發(fā)了另外4個(gè)標(biāo)記，對(duì)51個(gè)重組單株進(jìn)行分型，共得到10種不同的單體型，基于個(gè)體表型及單體型數(shù)據(jù)，Fnl7.1被縮小到25.4kb的區(qū)間（標(biāo)記InDel05和SNP01）（圖4c）。為了進(jìn)一步縮小區(qū)間范圍（老師態(tài)度很嚴(yán)謹(jǐn)，佩服），作者又構(gòu)建了一個(gè)更大規(guī)模的F₂分離群體（7600個(gè)單株），利用InDel05和SNP01進(jìn)行分型后又得到4個(gè)F₂重組單株。F2重組單株自交得到4個(gè)F_2:3群體，在InDel05–SNP01區(qū)間內(nèi)又開發(fā)了4個(gè)多態(tài)SNP標(biāo)記，用這些標(biāo)記對(duì)F_2:3群體進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)有2個(gè)F_2:3群體在標(biāo)記區(qū)間內(nèi)發(fā)生了重組。利用重組單株的表型及單倍型分型結(jié)果，將Fnl7.1定位在14.1kb的區(qū)間（圖4d），而在該區(qū)間內(nèi)共有2個(gè)基因，分別為CsGy7G014720和CsGy7G014730（圖4e）。

圖4?Fnl7.1精細(xì)定位過程

04 Fnl7.1功能驗(yàn)證

克隆雙親14.1kb定位區(qū)間，測(cè)序后進(jìn)行序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)共有17個(gè)SNP和InDel差異，部分變異位于基因間區(qū)、內(nèi)含子區(qū)，而位于外顯子區(qū)的則為非同義突變，另外在CsGy7G014720啟動(dòng)子區(qū)有多個(gè)變異。同時(shí)，作者發(fā)現(xiàn)InDel05（位于CsGy7G014720啟動(dòng)子區(qū)）與Fnl7.1共分離。以上結(jié)果表明，CsGy7G014720（后續(xù)稱作CsFnl7.1）是最有可能的候選基因。

圖5?CsFnl7.1表達(dá)分析

05 CsFnl7.1啟動(dòng)子多態(tài)性影響其表達(dá)

序列分析顯示，雙親CsFnl7.1啟動(dòng)子區(qū)存在多處序列差異（25個(gè)SNPs和7個(gè)InDels），因此作者將雙親的啟動(dòng)子進(jìn)行了克隆，分別與GUS基因構(gòu)建整合質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化煙草葉片進(jìn)行啟動(dòng)子活性分析。發(fā)現(xiàn)Jin5-508啟動(dòng)子（pCsLEA^J）活性是YN啟動(dòng)子（pCsLEA^Y）活性的4倍（圖6）。這與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果一致（授粉當(dāng)天CsFnl7.1在Jin5-508表達(dá)量顯著高于YN），從而說(shuō)明CsFnl7.1表達(dá)受順式調(diào)控。

圖6?雙親CsFnl7.1啟動(dòng)子活性比較

06? CsFnl7.1轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)

為進(jìn)一步驗(yàn)證基因功能，作者將CsFnl7.1轉(zhuǎn)入短把品種“D8”中，得到3個(gè)T2代單株（OE4、OE7和OE8）。Southern雜交顯示OE4、OE7和OE8分別插入1、1和2個(gè)拷貝（圖7a）。與對(duì)照相比，3個(gè)轉(zhuǎn)基因個(gè)體CsFnl7.1表達(dá)量顯著提高，同時(shí)果把長(zhǎng)度也更長(zhǎng)，說(shuō)明CsFnl7.1確實(shí)能夠影響果把長(zhǎng)度（圖7b,c,d）。分析果把果肉細(xì)胞的個(gè)數(shù)和大小發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因個(gè)體比對(duì)照個(gè)體細(xì)胞更大，但細(xì)胞數(shù)在兩者之間沒有顯著差異（圖7e,f,g），從而說(shuō)明CsFnl7.1是通過調(diào)控細(xì)胞伸展來(lái)影響果把長(zhǎng)度。

圖7?CsFnl7.1轉(zhuǎn)基因個(gè)體表現(xiàn)

07? CsFnl7.1與細(xì)胞伸展相關(guān)蛋白存在互做

利用酵母雙雜技術(shù)，以CsFnl7.1蛋白為誘餌篩選與其互做的蛋白，結(jié)果顯示共得到53個(gè)陽(yáng)性克隆，在這些蛋白中有多個(gè)與細(xì)胞伸展相關(guān)，包括CsDRP6和CsGLP1（圖8a）。體外pull down實(shí)驗(yàn)顯示，融合蛋白HIS-CsDRP6和HIS-CsGLP1可以被GST-CsFnl7.1高效捕獲，而對(duì)照GST則不能（圖8b）。以上結(jié)果充分說(shuō)明CsFnl7.1與CsDRP6、CsGLP1之間存在互做關(guān)系。

圖8?酵母雙雜及pull?down分析

08? Fnl7.1的地理分布及進(jìn)化分析

利用Fnl7.1啟動(dòng)區(qū)的變異信息，對(duì)158個(gè)品種進(jìn)行進(jìn)化分析，結(jié)果顯示所有品種可被分為4個(gè)group，其中g(shù)roup1和group2主要包含來(lái)自于歐亞大陸的端果把品種，而group3主要為來(lái)自于東亞的短果把品種，來(lái)自印度多個(gè)品種在3個(gè)不同group都有分布，以上結(jié)果也可以證實(shí)Fnl7.1起源于印度的假說(shuō)。

總結(jié)

本文是一篇典型的基因克隆+驗(yàn)證的優(yōu)秀文章，從事農(nóng)作物、蔬菜功能基因研究的老師可以引用參考。該研究亮點(diǎn)是使用大規(guī)模F2分離群體，通過BSA分析+重組個(gè)體分析，就實(shí)現(xiàn)了基因的精細(xì)定位，從而避免了構(gòu)建高代回交群體的繁瑣過程，極大地縮短了基因克隆的周期，減少了多年雜交、標(biāo)記篩選等工作流程。當(dāng)然，能夠采用這種策略，也與物種繁殖周期、產(chǎn)籽量、QTL貢獻(xiàn)率等多個(gè)因素相關(guān)（我們會(huì)在下期著重討論這些問題），本研究的物種和性狀特征符合上述要求，所以能夠快速拿到基因。在這篇文章之前，2018年陳學(xué)好老師在The Plant Journal（IF=6.14）上發(fā)表了一篇黃瓜耐水淹基因克隆驗(yàn)證的文章“The major-effect quantitative trait locus CsARN6.1?encodes an AAA ATPase domain-containing protein that is associated with waterlogging stress tolerance by promoting adventitious root formation”，文章思路和方法與本文基本相似，也是采用大規(guī)模F2分離群體+BSA分析的方式，感興趣的老師可以參考學(xué)習(xí)。我們不難看出，只要方法選的對(duì)，再加上細(xì)致的研究工作，就可以持續(xù)發(fā)表高分文章！

提前劇透

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