隨著對腫瘤細(xì)胞的糖代謝重編程的認(rèn)識，有氧糖酵解對腫瘤治療的抑制作用越來越受到重視。糖酵解通路中的許多關(guān)鍵蛋白已被發(fā)現(xiàn)是治療和克服耐藥性的重要靶點。有氧糖酵解抑制作用的研究主要集中在實體腫瘤來源的細(xì)胞模型中，而白血病細(xì)胞模型中信息較少，尤其是白血病多藥耐藥（MDR）細(xì)胞。因此，有必要從腫瘤代謝的角度研究MDR的分子機制，探討白血病MDR細(xì)胞中有氧糖酵解對糖代謝和藥物敏感性的影響。
12月新鮮出爐的公司合作文章中，蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院甘肅省新藥臨床前研究重點實驗室的研究者借助轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，探究了白血病MDR細(xì)胞的代謝重編程機制，對于發(fā)現(xiàn)通過恢復(fù)白血病MDR細(xì)胞藥物敏感性以改善治療效果的治療策略有重要意義。
這篇文章中，作者在得到轉(zhuǎn)錄組測序篩選到的差異表達(dá)基因后，集中于“糖代謝”這一主要研究目的，通過差異表達(dá)基因在功能和通路上的注釋及富集分析，找到了關(guān)鍵的糖代謝相關(guān)基因，以及藥敏細(xì)胞和耐藥細(xì)胞間發(fā)生變化的信號通路，為后續(xù)研究奠定了堅實的基礎(chǔ)。這也是一種高效的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)深入挖掘方法。接下來，小編跟大家一起看看這篇文章吧。
研究背景
葡萄糖是癌細(xì)胞中最豐富的能量來源之一。除了食物攝取以外，葡萄糖主要來源是糖異生和糖原分解，屬于葡萄糖合成代謝途徑。相反，線粒體氧化磷酸化（OXPHOS）和糖酵解是葡萄糖分解代謝的兩條主要途徑。
常氧的正常細(xì)胞中，高水平的OXPHOS是細(xì)胞ATP的主要來源。然而，近年來發(fā)現(xiàn)，盡管存在充足的氧氣，但許多癌癥仍明顯依賴糖酵解作為一種重要的能量來源，即“有氧糖酵解”或“瓦博格效應(yīng)”，這已被廣泛認(rèn)為是代謝重編程的共同特征。此外，有氧糖酵解可能賦予腫瘤細(xì)胞以耐藥性，可能的原因有：1）細(xì)胞內(nèi)微環(huán)境酸化，可能會降低藥物吸收和效率；2）支持細(xì)胞增殖所需的大分子合成的中間代謝物增加；3）通過減少氧自由基來抗氧化損傷。此外，在化療作用下，腫瘤/白血病細(xì)胞可能會表現(xiàn)出額外的代謝重編程，從而獲得對抗腫瘤藥物的耐藥性。
阿霉素（ADM）是一種具有強烈毒性的抗腫瘤藥，臨床上用于治療急性淋巴細(xì)胞白血病、急性粒細(xì)胞白血病等。前人研究和作者前期的研究表明，K562/ADM耐藥細(xì)胞比其親代K562敏感細(xì)胞具有更高的有氧糖酵解活性，這意味著耐藥白血病細(xì)胞通過糖酵解重編程獲得了對細(xì)胞毒性藥物的適應(yīng)性。
在此，作者采用二代高通量測序技術(shù)對兩個細(xì)胞系間的差異表達(dá)基因（DEG）進(jìn)行分析，高度富集的DEG則為候選耐藥性相關(guān)基因。糖酵解途徑中，乳酸脫氫酶（LDHA）催化丙酮酸生成乳酸是關(guān)鍵步驟，而草酸是一種LDHA抑制劑，可用于抑制有氧糖酵解。用草酸和ADM單獨或聯(lián)合處理后，測定其對細(xì)胞活力、ADM細(xì)胞毒性、糖代謝和候選耐藥相關(guān)DEG表達(dá)的影響。
研究方法
1、材料
藥敏細(xì)胞系–K562人類白血病細(xì)胞系，ADM耐藥細(xì)胞系–K562/ADM細(xì)胞系。
2、轉(zhuǎn)錄組測序
兩種細(xì)胞系各三個樣本，提取總RNA，構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組文庫，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。
3、體外細(xì)胞毒性試驗
4、糖代謝指數(shù)測定試驗
5、Western blot
研究結(jié)果
1、轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)與糖代謝相關(guān)的基因
K562/ADM細(xì)胞與其親本K562細(xì)胞間基因表達(dá)譜的比較將為MDR的研究提供有價值的機制見解。藥敏細(xì)胞和耐藥細(xì)胞的基因表達(dá)比較顯示，兩者轉(zhuǎn)錄組之間存在巨大差異，共檢測到1742個DEG。然后，通過與GO、NR、Swiss-Prot、eggNOG和KEGG數(shù)據(jù)庫的比對，鑒定到了205個與代謝相關(guān)的DEG。其中，相比于藥敏細(xì)胞，耐藥細(xì)胞中有97個基因表達(dá)上調(diào)、108個基因表達(dá)下調(diào)，表明這些基因可能在K562/ADM細(xì)胞的耐藥性中起重要的作用。
DEG表達(dá)量聚類熱圖
作者進(jìn)一步鑒定了葡萄糖代謝中的酶和轉(zhuǎn)運體的相關(guān)DEG，發(fā)現(xiàn)K562/ADM細(xì)胞中GLUT3和GLUT4的基因表達(dá)水平較高，這些基因作為葡萄糖轉(zhuǎn)運體促進(jìn)葡萄糖的攝取。K562/ADM 細(xì)胞中，編碼糖酵解代謝相關(guān)酶（PFKM和ALDOC）的基因表達(dá)上調(diào)，而參與TCA的DH1、IDH2和SUCLG2基因則表達(dá)下調(diào)。此外在耐藥細(xì)胞中，糖異生關(guān)鍵酶基因PEPCK1表達(dá)下調(diào)，糖原分解關(guān)鍵酶基因PYGL表達(dá)上調(diào)，而參與糖原合成的關(guān)鍵蛋白基因GYG2表達(dá)下調(diào)。有趣的是，與前人的蛋白組學(xué)研究結(jié)果一致，耐藥細(xì)胞中PPP通路的關(guān)鍵酶G6PD下調(diào)。然而，參與嘌呤和胸腺嘧啶合成的關(guān)鍵酶PRPS2上調(diào)。
結(jié)果表明，白血病MDR細(xì)胞表現(xiàn)為糖代謝重編程。事實上，在前人和作者之前的工作中，也觀察到與藥敏細(xì)胞相比，耐藥細(xì)胞的糖酵解通量有所增加。
表1 糖代謝相關(guān)DEG
此外，KEGG聚類和富集分析顯示，與K562細(xì)胞相比，K562/ADM細(xì)胞中存在多個生物學(xué)過程的變化。為了進(jìn)一步闡明糖代謝重編程的分子機制，將DEG比對到參與葡萄糖代謝的相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。所有DEG都是比對到了信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，如MAPK、PI3K-AKT、HIF、Ras等。如圖，PI3K-AKT通路是DEG富集最多的通路。PI3K-AKT通路通過調(diào)節(jié)代謝分子（包括LDHA、HK-II和GLUT）的表達(dá)或移位，作為代謝穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)控因子。結(jié)果顯示，PI3K-AKT通路是K562/ADM細(xì)胞中最富集的上調(diào)通路，與糖代謝重編程和MDR的發(fā)展有關(guān)。
葡萄糖代謝的相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑
2、草酸可以有效恢復(fù)K562/ADM細(xì)胞對ADM的敏感性
如圖，單獨用草酸處理的兩個細(xì)胞系均呈現(xiàn)時間和劑量依賴性細(xì)胞毒性，但是細(xì)胞毒性相對較低。相比于單獨用ADM處理，用ADM和草酸聯(lián)合處理后，K562細(xì)胞和K562/ADM細(xì)胞增殖抑制率分別提高了為2.28±0.56倍和6.08±0.77倍，K562/ADM細(xì)胞增殖抑制率的增加倍數(shù)明顯高于K562細(xì)胞。
這些數(shù)據(jù)表明，盡管耐藥的K562/ADM細(xì)胞系對藥物的敏感性不如其親本細(xì)胞系，但與草酸聯(lián)合使用時，其療效顯著提高。因此，抑制糖酵解可使K562/ADM細(xì)胞恢復(fù)ADM敏感性。
草酸和ADM對藥敏、耐藥細(xì)胞的影響
3、草酸對糖代謝通量和LDHA活性的抑制作用
在上述試驗中，作者發(fā)現(xiàn)ADM聯(lián)合草酸處理增加了人白血病細(xì)胞的細(xì)胞毒性。然后，作者研究了草酸對ADM處理的K562和K562/ADM細(xì)胞系糖代謝作用的影響，發(fā)現(xiàn)相比于ADM單獨處理，ADM和草酸共同處理48h后，兩個細(xì)胞系的葡萄糖消耗和乳酸生成的抑制作用均有所增強。草酸導(dǎo)致兩種細(xì)胞系糖酵解抑制呈現(xiàn)劑量依賴性增加，而耐藥細(xì)胞糖酵解抑制的變化倍數(shù)更高，這與聯(lián)合處理時耐藥細(xì)胞療效升高倍數(shù)更高所一致，說明草酸對糖酵解的抑制導(dǎo)致葡萄糖消耗和乳酸生成的減少，導(dǎo)致白血病細(xì)胞對ADM的敏感性增加。
相對LDHA活性檢測結(jié)果表明，草酸對K562細(xì)胞LDHA活性的抑制作用高于K562/ADM細(xì)胞。說明在K562細(xì)胞和K562/ADM細(xì)胞中，草酸對糖酵解通量的限制作用是不同的，不能用只通過競爭性抑制LDHA活性來解釋，因此草酸抑制LDHA并不是提高ADM療效的唯一機制。
4、草酸抑制ADM誘導(dǎo)的AKT-mTOR-c-Myc通路的過度激活
上述轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示，在K562/ADM細(xì)胞中，PIP3-AKT通路上調(diào)，此通路是糖代謝穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)控因子，可能與耐藥性增強有關(guān)。此外，草酸對糖酵解的抑制有效提高了K562/ADM細(xì)胞的ADM細(xì)胞毒性。此外，作者推測草酸誘導(dǎo)的LDHA抑制并不是草酸提高ADM療效的唯一機制。因此，為了研究草酸的使用是否也影響了PIP3-AKT通路，作者用草酸、ADM單獨或聯(lián)合處理K562細(xì)胞和K562/ADM細(xì)胞后，通過western blot檢測PIP3-AKT通路中一系列重要信號分子的表達(dá)水平。
結(jié)果表明，草酸逆轉(zhuǎn)了ADM誘導(dǎo)的K562/ADM細(xì)胞中t-AKT和p-AKT473的上調(diào)、t-mTOR和p-mTOR的上調(diào)。在K562/ADM細(xì)胞中，ADM和草酸聯(lián)合處理時顯著下調(diào)的AKT-mTOR-HIFα可能導(dǎo)致更有效地抑制AKT-mTOR-c-Myc的過度活化，從而影響ADM耐藥性。而AKT/mTOR/HIF/c- Myc的下游效應(yīng)物—GLUT4和HK-II檢測結(jié)果表明，ADM和草酸聯(lián)合處理后，K562/ADM細(xì)胞中的兩種效應(yīng)物變化趨勢與mTOR相似。
因此，cADM和草酸聯(lián)合處理不僅可以直接競爭LDHA活性，也會中和耐藥細(xì)胞中ADM引起的AKT-mTOR-c-Myc通路超活化，以及進(jìn)一步的AKT-mTOR-HIFα-GLUT4/HK-II受損。
草酸和ADM對PIP3-AKT通路的影響
總結(jié)
為了研究有氧糖酵解在白血病耐藥中的分子機制和作用，作者通過轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)了MDR白血病細(xì)胞系K562/ADM與其親本-藥敏細(xì)胞系K562的差異表達(dá)基因，并對DEG進(jìn)行聚類和富集分析。采用乳酸脫氫酶抑制劑–草酸評價糖酵解抑制對K562/ADM細(xì)胞ADM敏感性及關(guān)鍵DEG表達(dá)的影響。
作者發(fā)現(xiàn)K562/ADM細(xì)胞與K562細(xì)胞共有1742個DEG。參與糖代謝的單基因編碼酶的差異表達(dá)基因表明，K562/ADM細(xì)胞的有氧糖酵解通量較大，而PI3K-AKT信號通路與糖代謝有關(guān)，在K562/ADM細(xì)胞中表現(xiàn)出明顯上調(diào)。草酸通過下調(diào)AKT-mTOR通路直接或間接抑制有氧糖酵解，改善ADM在ADM耐藥細(xì)胞中的治療效果，并使其重新敏化。
總之，ADM耐藥性是由有氧糖酵解的增加介導(dǎo)的，與MDR白血病細(xì)胞中AKT-mTOR-c-Myc通路的過度激活有關(guān)。抑制有氧糖酵解和下調(diào)有氧糖酵解中的相關(guān)信號通路是一種潛在的使得白血病細(xì)胞致敏，從而克服MDR的化療策略。
參考文獻(xiàn)
Zhang X , Chen J , Ai Z , et al. Targeting glycometabolic reprogramming to restore the sensitivity of leukemia drug-resistant K562/ADM cells to adriamycin[J]. Life Sciences, 2018.
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