轉(zhuǎn)錄組多組學(xué)解析揭示Tfr1基因?qū)γ咨窘M織的產(chǎn)熱能力以及分化的影響

6月新鮮出爐的公司合作文章中浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究者借助轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，探究了Tfr1基因?qū)ψ厣?米色脂肪組織產(chǎn)熱能力和組織分化方面的功能，為肥胖與代謝疾病的治療策略提供了新方向。

研究背景

人體內(nèi)存在著白色脂肪組織（white adipose tis sue，WAT）、棕 色 脂 肪 組 織（brown adipose tissue， BAT）和米色脂肪組織。WAT具有儲能的作用，過量積聚可導(dǎo)致肥胖；棕色脂肪為產(chǎn)熱脂肪。米色脂肪是白色脂肪組織在寒冷、運動、藥物等作用下發(fā)生“棕色化”形成。米色脂肪具有不同于白色脂肪和棕色脂肪的形態(tài)和功能，具有增加機(jī)體產(chǎn)熱、促進(jìn)能量消耗，抑制肥胖形成的發(fā)等作用。因此近幾年來促進(jìn)米色脂肪生成成為肥胖癥等代謝疾病治療的研究熱點。

技術(shù)平臺

RNA-seq、Chip-seq、蛋白組

研究材料及思路

研究結(jié)果

 

1. 多組學(xué)鎖定研究目標(biāo)-Tfr1基因

Fig 1 在CL-316，243處理的小鼠中Tfr1基因?qū)﹁F穩(wěn)態(tài)起著至關(guān)重要的作用

本研究首先利用Chip-seq （Fig 1A/B）、RNA-seq（Fig 1D/E）、蛋白組三種技術(shù)手段，從轉(zhuǎn)錄調(diào)控、mRNA、蛋白質(zhì)三個不同層面發(fā)現(xiàn)在實驗組（C57BL/6J mice）中與鐵轉(zhuǎn)運相關(guān)的啟動子 、基因、蛋白均有明顯的富集。為了驗證結(jié)果的準(zhǔn)確性，對與鐵轉(zhuǎn)運相關(guān)的啟動子進(jìn)行用Chip-qPCR（Fig 1C）的方法驗證，對鐵轉(zhuǎn)運相關(guān)的蛋白做了WB驗證（Fig 1G），結(jié)果都顯示Tfr1基因在實驗組（C57BL/6J mice）中的表達(dá)量明顯增加。綜上所述，Tfr1基因在CL-316，243處理的小鼠中Tfr1基因?qū)﹁F穩(wěn)態(tài)起著至關(guān)重要的作用。

2. Tfr1基因在米色脂肪組織和棕色脂肪組織的形成和產(chǎn)熱能力方面有重要作用

Fig2 Tfr1基因缺失可減少冷誘導(dǎo)的脂肪組織產(chǎn)熱

為了探究Tfr1基因在脂肪細(xì)胞的中有哪些作用，本研究構(gòu)建了Tfr1 敲除小鼠（Tfr1Adp/Adp ）和Tfr1 野生小鼠（ Tfr1fl/fl ）。對Tfr1Adp/Adp和Tfr1fl/fl的表型生理生化的指標(biāo)、mRNA、蛋白水平進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)相對于對照組來說Tfr1Adp/Adp 小鼠雖然在整體體重上沒有改變，但是其白色脂肪組織和棕色脂肪組織的重量明顯降低（Fig2 A/B）。經(jīng)過冷處理后對照組能很快維持溫度恒定（Fig2 C），形成更小的小脂滴（多房脂質(zhì)），但是實驗組維持溫度的能力明顯降低，也不能形成更小的小脂滴（多房脂質(zhì)）。在mRNA水平和蛋白水平，冷處理的實驗組中產(chǎn)熱相關(guān)基因、脂肪分解相關(guān)蛋白改變的程度都沒有對照組中明顯。這些現(xiàn)象表明Tfr1基因在棕色/米色脂肪細(xì)胞的發(fā)育和產(chǎn)熱能力維持的過程中有著重要的作用。

3. Tfr1基因在米色脂肪組織的產(chǎn)熱方面的機(jī)制

Fig3 Tfr1基因?qū)ρ€(wěn)定、胰島素敏感性、局部炎癥的影響

為了進(jìn)一步探究Tfr1基因在棕色/米色脂肪細(xì)胞的發(fā)育和產(chǎn)熱能力維持的過程的作用機(jī)制。分別對Tfr1Adp/Adp和Tfr1fl/fl 進(jìn)行高脂肪、正常喂養(yǎng)，并對4組樣本分別進(jìn)行葡萄糖耐量、胰島素抵抗、呼吸速率、能量消耗、CD11b+F4/80巨噬細(xì)胞、CD11c+巨噬細(xì)胞的比例等實驗。數(shù)據(jù)表明在高脂肪處理實驗組 中，整體體重（Fig3 A）、白色脂肪組織（Fig3 B）大小都沒有明顯的差異。然而在高脂實驗組中棕色脂肪組織完全轉(zhuǎn)化為白色脂肪組織（Fig3 B）。同時小鼠空腹血糖、血脂、非酯化脂肪酸脂肪酸的含量明顯高于高脂對照組。高脂喂養(yǎng)后，盡管血液中血糖含量沒有太大的變化，但是驗組中葡萄糖耐量、胰島素抵抗的值都要高于高脂對照組（Fig3E/F）。這說明高脂實驗組中糖耐受性受損可能是導(dǎo)致空腹血糖升高的原因。而呼吸速率、能量消耗的實驗表明缺失Tfr1基因后呼吸速率會增加，能量消耗能力降低（Fig3G/H）。在正常喂養(yǎng)的實驗組中白色脂肪組織相對于正常對照組來說明顯減少。 上述數(shù)據(jù)表明，能量消耗降低并沒有導(dǎo)致高脂喂養(yǎng)實驗組小鼠體重增加，可能是由于Tfr1缺失對白色脂肪細(xì)胞的內(nèi)在的影響。
通過免疫組化和流式細(xì)胞術(shù)實驗發(fā)現(xiàn)在高脂喂養(yǎng)的實驗組中巨噬細(xì)胞的數(shù)量在白色脂肪組織和棕色脂肪組織中都有增加，棕色脂肪組織中CD11c+ 巨噬細(xì)胞的數(shù)量要高于高脂對照組（Fig3J/K），同時棕色組織中也產(chǎn)熱相關(guān)的基因也發(fā)生較大的變化。透射電鏡的結(jié)果顯示高脂喂養(yǎng)的實驗組中線粒體會更小，顏色更深。這些結(jié)果均表明Tfr1 基因在脂肪細(xì)胞能量消耗扮演很重要的角色。
為了進(jìn)一步挖掘Tfr1 基因作用的機(jī)制，對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)再次進(jìn)行挖掘。在基因富集分析(GSEA)中發(fā)現(xiàn)與低氧相關(guān)的基因具有明顯的差異， Hif1α基因與同家族的其他基因在表達(dá)趨勢以及表達(dá)量上都有明顯的差異。在冷處理后，Hif1α蛋白和Tfr1蛋白的表達(dá)量都有上升。通過免疫熒光的結(jié)果顯示Hif1α位于細(xì)胞核內(nèi)。構(gòu)建了Hif1α基因敲除小鼠，并對冷處理下Hif1α基因表達(dá)量、蛋白水平、組織形態(tài)等結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Hif1α基因并非米色脂肪細(xì)胞產(chǎn)熱必要的基因。HIF1α ChIP-qPCR實驗發(fā)現(xiàn)Hif1α基因是通過調(diào)控Tfr1 基因的啟動子區(qū)域間接參與米色脂肪細(xì)胞產(chǎn)熱過程。

4. 在脂肪細(xì)胞中Tfr1基因缺失會促進(jìn)棕色脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)換為肌肉細(xì)胞

對Tfr1Adp/Adp和Tfr1fl/fl 進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析，發(fā)現(xiàn)在基因敲除小鼠中，棕色脂肪組織標(biāo)志性的基因明顯下降，白色脂肪組織標(biāo)志性基因明顯上升。但Lep基因卻例外，只有在冷處理后的實驗組中，表達(dá)量上升?；蚋患治霰砻鳎胁糠旨∪饧?xì)胞的標(biāo)志性基因、干細(xì)胞標(biāo)志性基因、及肌源性標(biāo)志性基因均有上調(diào)，而與氧化磷酸化、脂肪生成和脂肪酸代謝相關(guān)的基因卻明顯下調(diào)。免疫共沉淀的結(jié)果也顯示脂肪相關(guān)的蛋白含量降低，而肌纖維標(biāo)志蛋白含量明顯增加。上述結(jié)果表明，在脂肪細(xì)胞中Tfr1基因缺失會促進(jìn)棕色脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)換為肌肉細(xì)胞。

5. 總結(jié)

運用多組學(xué)的技術(shù)綜合研究發(fā)現(xiàn)Tfr1為米色脂肪細(xì)胞生熱調(diào)控重要的候選基因。研究表明當(dāng)小鼠米色脂肪細(xì)胞缺乏Tfr1會破壞產(chǎn)熱，胰島素抗性增加、同時伴有鐵缺乏性慢性炎癥和線粒體功能障礙。米色脂肪細(xì)胞冷處理可以維持HIF1a的穩(wěn)定，激活Tfr1基因，Hif1α基因可以減少產(chǎn)熱基因的表達(dá)，卻不改變米脂細(xì)胞體內(nèi)核心的溫度。值得注意的是，Tfr1在肩胛間棕色脂組織(iBAT)缺失會導(dǎo)致棕色前體脂肪細(xì)轉(zhuǎn)換為向白色脂肪細(xì)胞和肌肉細(xì)胞。相反，在tfr1缺失個體中，如飲食中長期缺乏鐵則不能轉(zhuǎn)化出現(xiàn)上述的轉(zhuǎn)化。此外，如果Tmprss6缺失也會小鼠腹股溝白色脂肪組織和肩胛間棕色脂組織兩個部位鐵缺乏。同時會激發(fā)低溫誘導(dǎo)型米色脂肪細(xì)胞形成和棕色脂肪產(chǎn)熱。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明不管是在依賴鐵離子或是不依賴鐵離子的產(chǎn)熱過程中Tfr1都起著重要的作用。