Nanopore測序錯誤率相對于二代平臺高，所以我們不推薦其做snp分析，但這不代表高深度ONT全基因組重測序不能用于snp分析。本期小編為大家分享一篇利用高深度ONT全基因組重測序進行snp分析以進行臨床應用的案例。
【研究背景和方法】
Nanopore長讀長測序在人類基因組測序方面主要優(yōu)勢集中于基因組組裝及結構變異檢測方面。由于其堿基錯誤率較高，其在臨床應用所需的單核苷酸變異（SNV）檢測方面存在困難。
為了評估納米孔測序在臨床人類基因組學的應用潛力，作者利用便攜式MinION三代測序儀測序了2個人類基因組：基因組參考樣本NA12878，增加其測序深度，以評估和校準三代nanopore變異檢測方法；然后對伴有嚴重免疫失調(diào)的共濟失調(diào)性全血細胞減少綜合征患者進行測序，以解決與分子遺傳學診斷相關的2種新生蛋白編碼變異的染色體定相（phasing）相關問題。
【研究結果】
1.對參考樣品進行MinION全基因組測序
GM12878人B淋巴細胞采用PCR擴增和6kb片段篩選的文庫制備方案，共計獲得45,740,123條reads（圖1a），平均讀取長度為6373bp（圖1b）在流動細胞中是一致的，并且基于測序文庫的物理大小選擇非常接近預期。總數(shù)據(jù)量為273.4Gb，每個flow cell的平均產(chǎn)量為3.7Gb（圖1c）。總計42,924,782個高質(zhì)量clean reads的比對率為99.3％，唯一比對率為88.8％。
比對上的reads平均堿基替換SNV發(fā)生率為12.7％（與參考堿基不同的頻率），平均缺失率為4.7％（參考序列中堿基缺失的頻率），平均插入率為3.2％（圖1d）。作者還評估了不同堿基識別算法對reads水平z確性的影響，發(fā)現(xiàn)Albacore v2.0.2實現(xiàn)了*低的未過濾替換錯誤率和缺失錯誤率，而其他方法具有較低的插入錯誤率。
平均每個堿基覆蓋深度（不包括缺失）為81.7X（圖1e），其中90.4％的基因組區(qū)域被至少40個reads覆蓋。9.6％人基因組區(qū)域覆蓋深度降低（<40×），反映文庫制備方案的PCR步驟中的擴增偏差（圖1f）。
圖1
2.NA12878中的單核苷酸變異SNV檢測
使用multi-platform Genomes in a Bottle (GIAB)作為黃金標準真實數(shù)據(jù)集評估ONT檢測SNV的z確性。NA12878樣本22號染色體數(shù)據(jù)運行FreeBayes方法檢測SNV，選擇獲得*佳F1分數(shù)的參數(shù)，與GIAB參考變異檢測集相比，實現(xiàn)了99.9％的總體一致性z確度，并且觀察到12.8％的錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）和14.4％假陰性率（FNR），結合創(chuàng)造了86.4％的F1分數(shù)（表1）。在全基因組水平使用上述參數(shù)，獲得了10.9％的FDR，12.5％的FNR和88％的F1分數(shù)。
表1
為了更好地理解變異檢測錯誤的潛在來源，作者注釋了變異檢測位點，其中包含一系列關于參考序列和跨越位點的reads注釋。這些包括接近均聚物重復區(qū)域、較低的覆蓋深度、鏈偏好和存在大量短缺失的reads覆蓋區(qū)域（圖2左）。表明，假陽性（FP）和假陰性的主要驅(qū)動因素是均聚物和低覆蓋率。此外，使用高質(zhì)量評分閾值（QUAL）來維持可接受的FDR會產(chǎn)生許多假陰性。
圖2
初始變異集中的大部分假陽性基因型是雜合基因型。使用ONT數(shù)據(jù)的好處是跨越多個雜合位點的長reads提供了糾正此問題的機會。當reads被分成代表親本單倍型的2組時，預期真陽性變異等位基因只固定在一個定相組（親本單倍體）存在，而假陽性變異預期在組之間均勻分布。據(jù)此，作者開發(fā)了單樣本、基于reads、無參考panel的定相算法。
使用過濾器改進變異檢測，通過phasing和注釋過濾器（Post?phasing classification）顯著改善變異檢測，*佳結果F1評分為92.2％，F(xiàn)DR為7.1％，F(xiàn)NR為8.5％（表1，圖2中）。進一步考慮覆蓋深度>=60X的假定變異位點（基因組的85％）時，觀察到F1得分改善至93.6％，F(xiàn)DR為6.1％，F(xiàn)NR為6.6％（圖2右），這意味著減少或消除覆蓋深度偏差源（如PCR）的操作改進在提高z確性方面可以發(fā)揮一定作用。(百邁客目前ONT全基因組重測序和ONT全基因組甲基化測序建庫過程正是PCR-free建庫–direct-DNA建庫，一是可減少覆蓋深度偏好，有利于提高變異檢測z確度；二是可以保留堿基修飾信息，同時檢測甲基化修飾等信息)
在推定的致病LOF變異（功能缺失突變：本文針對終止密碼子獲得和剪接位點突變）中，與全基因組真陽性突變（173/788782,0.02％）相比，F(xiàn)Ps（假陽性突變，69/45219,0.15％）富集，但FPs在高度不耐受LOF突變的基因（pLI>0.90,17 FP對20 TP）與LOF突變耐受基因（pLI <= 0.10,46 FP對122 TP）中成比例地富集。
在每條read隨機堿基替換錯誤和無基因組擴增偏差的理想化模型下模擬NA12878數(shù)據(jù)集，與實測數(shù)據(jù)比較，表明均聚物缺失錯誤累積導致缺失變異檢測錯誤，納米孔測序中增加的測序覆蓋深度以減小均聚物相關FDR，目前受到基因組范圍的in-read缺失率的限制。
3.NA12878樣本突變定相
基因型是通過母本或父本單倍型遺傳的，但大多數(shù)基因分型方法，會產(chǎn)生非定相基因型檢測，即無法區(qū)分單倍型。基因型定相很有意義，除了上述促進變異檢測z確性的改進之外，還能夠進行許多遺傳分析，比如臨床用途中解決多個雜合LoF變異的共分離和鑒定新生突變的起源親本。作者開發(fā)的新型定相算法相比于其他算法，具有更低的錯誤率，其定相√確度類似于使用非常大的參考panel從SNP基因分型陣列數(shù)據(jù)定相常見變異所獲得的定相√確度。
4.NA12878樣本大片段結構變異檢測
大的結構變異相對于snp和indel少見，但其對罕見疾病的影響可能甚至比目前估計的更大，因為現(xiàn)有分析檢測這些突變存在技術困難。采用Sniffles檢測22號染色體SV變異，共計檢測到82個，其中22個是在GIAB真實數(shù)據(jù)集中存在的，之后通過ONT、Illumina和PacBio reads覆蓋數(shù)據(jù)來判斷剩余的60個SV：其中21個SV被Pacbio檢測到或reads強烈支持，31個SV僅ONT reads明顯證實，但PacBio reads很少或不支持。ONT特異性檢測SV可能代表其他技術遺漏的真實缺失、由PCR擴增產(chǎn)生的假象或在NA12878細胞系的細胞培養(yǎng)期間發(fā)生的亞克隆缺失。作者發(fā)現(xiàn)目前ONT平臺允許檢測大的缺失，靈敏度在60％-91％（21/35和32/35）。
僅ONT檢測到的缺失突變示例
5.使用MinION對臨床樣品進行全基因組測序
鑒于長reads可成功地檢測雜合變異，作者試圖使用全基因組納米孔測序來解決具有不確定的免疫調(diào)節(jié)病癥的個體基因組臨床問題。簡而言之，女性患者最初在嬰兒期出現(xiàn)復發(fā)性感染、低丙種球蛋白血癥、血小板減少癥和輕度貧血，并且在兒童時期出現(xiàn)慢性炎癥，在成年早期出現(xiàn)進行性神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。
患者及其父母組成的核心家系3個樣本Illumina平臺全基因組重測序（PE 126bp）結果：發(fā)現(xiàn)了84個高置信度的新生SNV，一個接近預期范圍上限的數(shù)字，這與受孕時的父母年齡（母親是38歲，父親39歲）一致。其中3個變異預測為導致蛋白序列改變，2個位于SAMD9L基因蛋白質(zhì)編碼區(qū)中。該基因中罕見的雜合變異最近涉及常染色體顯性遺傳性共濟失調(diào)性全血細胞減少綜合征（OMIM：＃159550），并且有證據(jù)表明造血組織的出生后逆轉可能與較輕微的疾病表現(xiàn)相關。雖然這2個非同義突變（c.1076 G>A和c.3353 A>G; p.R359Q和p.Y1118C，NM_152703.3）位于同一個外顯子中，但它們相距2277 bp，所以不能直接使用Illumina reads進行定相；其附近缺乏遺傳的雜合變異也阻止將突變定相于親本單倍型。解釋這個問題對于解釋每個等位基因的致病潛力非常重要，解決此類問題的能力與類似情況下的生殖決策直接相關。
全血樣本Nanopore全基因組重測序結果：在34個R9.4 MinION flowcell中共計產(chǎn)生122 Gb數(shù)據(jù)量（16,692,656 reads，約40X），比對率為99.1％。通過上述在NA12878樣本確定的變異檢測和定相方法進行分析。
ONT數(shù)據(jù)基因組覆蓋深度統(tǒng)計
不出所料，ONT數(shù)據(jù)也鑒定到了具有預期雜合基因型的c.1076 G> A和c.3353 A> G變異。使用ONT reads對其他附近變異進行定相，以確認新生變異的遺傳和來源（圖3）。這2個新生突變被定相于一個199kb的block內(nèi)，33條reads（6.1-18.9kb）跨越2個新生突變位點，11條reads包含新生突變等位基因，8條reads包含2個參考等位基因，表明突變的等位基因是順式的（來自于同一條染色體）。（NA12878數(shù)據(jù)中沒有reads跨越包含2個位點的突變等位基因。）使用一系列等位基因特異性PCR實驗證實來自ONT reads的新生等位基因的單倍型構象。相位區(qū)中的側翼位點表明，父系遺傳的單倍型出現(xiàn)了新生變異（圖3）。
圖3及等位基因特異性PCR結果
注：前3行為未定相母親（MI），父親（FI），先證者（PI）基因型，第4行為先證者單倍型Phased proband genotypes (PN)。藍色=alt ，橙色=ref。PN下面2行為單倍型1（母系遺傳）或單倍型2（父系遺傳）對應的reads，其中對于每條read，堿基是矩形，reads跨度以水平線顯示。間隙代表gap（缺失）。底部顯示物理位置，感興趣的位點為紅色?；贕RCh37 NM_152703.3, 92761932 T>C對應于c.3353 A>G，92764209 C>T對應于c.1076 G>A。
【討論】
該研究首次詳細評估了ONT測序?qū)θ祟悩颖镜淖儺悪z測和基因分型、染色體定相（單倍型分析）的z確性。雖然很有希望，在總共107個MinION flowcell中對這2個人類基因組進行測序是一項重大任務，在技術和計算等方面具有挑戰(zhàn)。最近商業(yè)化推出的PromethION是一種更高通量的納米孔測序儀，自帶數(shù)據(jù)處理功能，有望解決人類基因組規(guī)模數(shù)據(jù)中的許多挑戰(zhàn)。（百邁客與Oxford Nanopore公司合作-斥巨資引進Nanopore全測序平臺）最后，雖然變異檢測的總體z確性仍存在局限性，但該工作突出了錯誤上下文，這些錯誤上下文將受益于基本檢測、reads比對和一致性變異檢測方法的改進，并說明了將ONT應用于臨床目的的途徑。
【小編碎語】
隨著nanopore測序技術的發(fā)展更新，比如ONT內(nèi)測的R10芯片75X達到一致性質(zhì)量值Q50，比如新的”flip-flop”堿基識別軟件可將R9一致性z確性提升至Q42等。總之，ONT長讀長測序錯誤率down down down，測序通量up up up，測序價格low low low，三代取代二代指日可待。誰說魚（長讀長）和熊掌（z確度）不可兼得呢。
Bowden R, Davies R W, Heger A, et al. Sequencing of human genomes with nanopore technology[J]. Nature communications, 2019, 10(1): 1869.
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