本期小編為各位介紹ONT全長轉(zhuǎn)錄組測(cè)序應(yīng)用于聽覺相關(guān)細(xì)胞isoform分析案例。
材料方法
單細(xì)胞RNA測(cè)序是一種強(qiáng)有力的工具，通過它可以表征低豐度細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)錄特征，但它在內(nèi)耳的應(yīng)用受到了骨迷路、感覺細(xì)胞在組織分布稀疏和難以分離膜性耳蝸超稀少細(xì)胞的困難。
1、從p15、p30、p70和p228雄性和雌性C3-Heb/FeJ小鼠（Mus?musculus）收獲耳蝸組織，倒置顯微鏡下鑒定并使用顯微操作吸管法分離目的細(xì)胞：IHCs、OHCs和Deiters細(xì)胞（Deiters’?cells，DCs）。（內(nèi)毛細(xì)胞（inner?hair?cells，IHCs）和外毛細(xì)胞（outlier?hair?cells，OHCs）；Deiters細(xì)胞是哺乳動(dòng)物耳蝸內(nèi)的一種支持細(xì)胞，與外毛細(xì)胞(OHC)的關(guān)系非常密切。）
2、SmartSeq2單細(xì)胞擴(kuò)增，IHC?(n?=?42),?OHC?(n?=?127),?and?DC?(n?=?39)進(jìn)行二代Illumina平臺(tái)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序；12個(gè)p15小鼠OHCs進(jìn)行ONT全長轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。
研究結(jié)果
1、耳蝸非感覺細(xì)胞豐度估計(jì)與單細(xì)胞分離
與哺乳動(dòng)物耳蝸中的各種支持細(xì)胞類型相比，聽覺HC的豐度較低。為了估計(jì)小鼠耳蝸膜迷路中可用于單細(xì)胞分離的HC數(shù)量，據(jù)報(bào)道在成熟的小鼠耳蝸中約765個(gè)IHCs，通過對(duì)小鼠顳骨中心切片，細(xì)胞核計(jì)數(shù)，估計(jì)小鼠膜性迷路中的細(xì)胞數(shù)為415,395，其中IHC和OHC比例僅為0.19％和0.59％。
為了研究占比極低的目的細(xì)胞，作者進(jìn)行了細(xì)胞分離，詳細(xì)方法見文章。本研究主要關(guān)注具有明顯不同形態(tài)特征的IHC?(n?=?42),?OHC?(n?=?127),?and?DC?(n?=?39)，同時(shí)他們來自于不同發(fā)育時(shí)期：p15（過濾后n=132）、p30（n=6）、p70（n=54）和p228（n=6）。該設(shè)計(jì)有利于時(shí)間和tono-topic差異表達(dá)分析。（聽覺系統(tǒng)對(duì)語音的基本表達(dá)方式是“音調(diào)拓?fù)涞摹?tono-topic),即基底膜及毛細(xì)胞都具有頻率選擇及分解作用,可以把進(jìn)入耳蝸的聲波分解為一組不同的頻率成分,或者說用這組頻率成分來表達(dá)原聲波信號(hào)。）
2、質(zhì)控、無偏聚類及表達(dá)譜分析
去除有表達(dá)的基因（count值>0的）少于2000個(gè)的細(xì)胞，接下來進(jìn)行主成分分析PCA分析和tSNE聚類分析。由于在所有細(xì)胞類型中Top?100高表達(dá)基因表達(dá)水平不一致，去除了7個(gè)細(xì)胞數(shù)據(jù)；由于未與形態(tài)學(xué)分組聚類到一起，去除3個(gè)細(xì)胞數(shù)據(jù)。剩余的一組高質(zhì)量細(xì)胞數(shù)據(jù)，在每個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的總reads中含有低百分比的線粒體轉(zhuǎn)錄本，這是值得注意的，因?yàn)槊總€(gè)細(xì)胞線粒體reads數(shù)百分比增加表明細(xì)胞死亡增加。
使用Seurat進(jìn)行基于主成分1和2的無偏差聚類（圖1E）。得到的tSNE?clusters顯示IHC、OHC和DC分離明顯，形成與其形態(tài)學(xué)分組一致的無偏細(xì)胞特異性組（圖1F）。為了鑒定每種細(xì)胞類型的特征性表達(dá)模式，在AUC分類器下為每種細(xì)胞類型提取了前100個(gè)cluster定義基因（圖1G）。
為了比較細(xì)胞類型之間表達(dá)譜，計(jì)算各cluster內(nèi)所有細(xì)胞中每個(gè)基因平均表達(dá)水平。通過維恩圖對(duì)平均表達(dá)譜比較，每種細(xì)胞類型約表達(dá)700個(gè)特異基因（OHC-753;?IHC-655;?DC-713；歸一化后counts>10）。且發(fā)現(xiàn)IHCs和DC具有高比例重疊（共享750個(gè)基因，與OHC和DC共享564個(gè)基因相比），但是IHC和OHC共享771個(gè)基因表達(dá)（圖2A）。為了更嚴(yán)格地測(cè)試每種細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)錄相似性，使用所有基因進(jìn)行Pearson相關(guān)和R2回歸分析?；貧w分析，所有3組間比較中發(fā)現(xiàn)了強(qiáng)相關(guān)性，OHCs和IHC之間的相關(guān)性最高，OHCs和DC之間的相關(guān)性最低。OHC和DC表達(dá)譜最不相似可能反映了OHC高水平特化（圖2B）。
為了定義每種細(xì)胞類型的特征性表達(dá)譜，通過cluster內(nèi)各個(gè)細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)水平對(duì)所有基因進(jìn)行排序。每種細(xì)胞類型的表達(dá)譜通過少量高表達(dá)基因（對(duì)數(shù)平均表達(dá)水平在2和7之間）和大量低表達(dá)基因（對(duì)數(shù)平均表達(dá)水平<2）來表征（圖2C，2E和2G）。在按細(xì)胞類型排名前50的最高表達(dá)基因中，一些基因，如Fbxo2和Skpa1，在所有3種細(xì)胞類型中高度表達(dá)；而其他基因，如Ocm和Fgfr3，主要僅在一種細(xì)胞類型中表達(dá)。使用AUC排序，提取每組的cluster定義基因以鑒定特定細(xì)胞類型特異性marker基因（圖2D，2F和2H）。前10個(gè)cluter定義基因的小提琴圖揭示了眾所周知的marker基因OHC（Ocm和Slc26a5）、IHC（Otof和Atp2a3）和DC（Bace2和Ceacam16）。可以通過scRNA-Seq瀏覽器工具（Web資源：https://morlscrnaseq.org/）訪問小提琴圖對(duì)應(yīng)的完整基因列表。
3、差異表達(dá)分析
已知細(xì)胞類型marker基因高度差異表達(dá)，例如prestin（Slc26a5），其在OHCs中穩(wěn)健且差異表達(dá)。與公布的OHC和IHC轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，搜索具有不一致排名的基因，假設(shè)通過AUC而不是表達(dá)水平對(duì)基因進(jìn)行排序?qū)⒃诟鼜V泛的表達(dá)水平上鑒定細(xì)胞類型定義基因。按AUC分類排名時(shí)，兩個(gè)鈣相關(guān)基因Ocm和Sri在OHC定義基因列表中排名第一，甚至超過Slc26a5，排名第三（上圖2F）。先前已在OHC中報(bào)道了Ocm的表達(dá)。編碼蛋白質(zhì)oncomodulin（癌調(diào)蛋白）是鈣結(jié)合蛋白家族成員之一，它是耳蝸聽力擴(kuò)增所必需的。Sri編碼sorcin（可溶性耐藥相關(guān)鈣結(jié)合蛋白），一種在心肌細(xì)胞中表達(dá)的蛋白質(zhì)，是鈣介導(dǎo)的興奮-收縮偶聯(lián)所必需的，通過抑制Ryr通道（Ca2+釋放通道/RyR受體）進(jìn)行鈣離子介導(dǎo)的鈣離子釋放?(CICR)。在肌細(xì)胞中，Ryr通道介導(dǎo)CICR，能夠從肌質(zhì)網(wǎng)中快速釋放Ca2+離子，從而產(chǎn)生對(duì)于肌肉收縮必不可少的時(shí)空限制性鈣火花。
免疫熒光僅將sorcin僅定位于OHC（圖3A，3B），假設(shè)類似的機(jī)制可以調(diào)節(jié)基于prestin的運(yùn)動(dòng)（圖3C和3D，動(dòng)力蛋白?Prestin是一種高度專業(yè)化的蛋白質(zhì),可以起到驅(qū)動(dòng)耳蝸中外部毛細(xì)胞的作用,使耳蝸可以讓人們和動(dòng)物聽到聲音）。與此可能性一致，作者確定了在OHCs中表達(dá)sorcin介導(dǎo)的興奮-收縮途徑的基本組分，包括（1）電壓門控鈣釋放通道，（2）促進(jìn)CICR的通道，（3）終止CICR的機(jī)制（sorcin），和（4）鈣泵使釋放的Ca2+返回Ca2+儲(chǔ)庫（圖3E）。本數(shù)據(jù)集和他人數(shù)據(jù)集中檢測(cè)到的第一個(gè)組分是耳聾基因Cacna1d，一種在OHCs中高表達(dá)的電壓門控鈣釋放通道，參與心動(dòng)過緩有關(guān)的綜合征性耳聾；第二個(gè)組分，即促進(jìn)CICR的通道，包括Ryr1、Ryr2和Ryr3。在通過Ryr通道誘導(dǎo)CICR后，sorcin的作用可能是通過在Ca2+存在下阻斷Ryr受體來快速終止CICR，這是先前在心肌細(xì)胞中報(bào)道的途徑。已知定位于OHC表面下池的Ca2+?ATP酶泵可從細(xì)胞溶質(zhì)中除去Ca2+。附著蛋白質(zhì)（Ocm）等結(jié)合并緩沖Ca2?+的輔助蛋白質(zhì)可能有助于這一過程。
4、轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)分析
大多數(shù)耳聾相關(guān)基因在IHC和OHC中表達(dá)，但它們?cè)谶@些細(xì)胞中的isoform結(jié)構(gòu)仍未得到很好的解析。SmartSeq2單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，可克服細(xì)胞異質(zhì)性和低豐度表達(dá)，以定義聽覺HC中的基因產(chǎn)物結(jié)構(gòu)，比如可變剪切。小鼠Myo15中檢測(cè)到已報(bào)道的3個(gè)事件：（1）可變轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)TSS事件：mm10?chr11：60,480,418-60,480,621；（2）位于chr11的6bp外顯子：60,486,893-60,486,898；（3）剪接受體位點(diǎn)導(dǎo)致在位置chr11：60,497,434-60,497,576的提前終止。另外，檢測(cè)到3個(gè)新的未報(bào)道注釋的features：包括未報(bào)道的OHC特異性可變剪接受體位點(diǎn)（chr11：60,483,616-60,483,806），其中包含移碼和提前終止，表明可能的功能作為調(diào)控元件，與報(bào)道位于chr11位置的剪接受體位點(diǎn)：60,497,434-60,497,576類似，以及位于chr11的剪接位點(diǎn)：3’UTR中的剪切位點(diǎn)：60,527,450-60,527,710。
鑒定孟德爾耳聾的基因中未注釋的feature，在12個(gè)聽力喪失基因中鑒定出20個(gè)高度保守的未注釋外顯子（表1;圖4和5）。鑒定的編碼和非UTR含有外顯子的平均大小為55bp，這些外顯子位于小鼠外顯子的最小十分位數(shù)中（33％的小鼠外顯子<100bp;?6.9％<50bp）。
5、全長isoform鑒定
為了解決全長isoform結(jié)構(gòu)，進(jìn)行了ONT全長轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，并使用Illumina短reads序列數(shù)據(jù)作為確認(rèn)的scaffold，用于nonopore長讀長數(shù)據(jù)比對(duì)。與150-800bp片段大小的Illumina?reads不同，Nanopore測(cè)序不需要片段化文庫，并且可以產(chǎn)生跨越mRNA轉(zhuǎn)錄本長度的單一reads（圖6A和6B）。對(duì)p15時(shí)間點(diǎn)的12個(gè)OHC細(xì)胞加barcaod以在4個(gè)MinION?R9.4?flow?cell上測(cè)序所有樣品，同時(shí)保持單細(xì)胞分辨率（圖6A）。因?yàn)镺HCs是最多和最差異的Illumina數(shù)據(jù)集，這有助于跨平臺(tái)比較以驗(yàn)證長reads和isoform定量。
長讀長ONT全長數(shù)據(jù)顯示出驚人的isoform異質(zhì)性。例如，檢測(cè)到445個(gè)reads比對(duì)到耳聾相關(guān)基因Cabp2。通過Mandalorion?pipeline鑒定了14種不同isoform。但當(dāng)高度相似的isoform?configurations(構(gòu)型)組合去冗余時(shí)，該數(shù)量下降至5（圖6B）。通過量化每種isoform的豐度，在每個(gè)單獨(dú)的細(xì)胞和更廣泛的OHC組中鑒定了主要的isoform configurations(構(gòu)型)（圖6C-6E）。最常檢測(cè)到和大量表達(dá)的configurations是isoform1。查詢了公開可用的鼠注釋數(shù)據(jù)庫（RefSeq，GenBank，GENCODE和UCSC基因）和數(shù)據(jù)集（來自GenBank和UCSC基因組瀏覽器的mRNA），但未發(fā)現(xiàn)該isoform的注釋。除了它在小鼠中的缺失外，還無法在RefSeq，GenBank，GENCODE和UCSC人類數(shù)據(jù)庫中鑒定出與isoform1結(jié)構(gòu)上直系同源的轉(zhuǎn)錄本。
小結(jié)
Highlight
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單細(xì)胞RNA-seq可鑒定內(nèi)毛細(xì)胞（inner?hair?cells，IHCs）和外毛細(xì)胞（outlier?hair?cells，OHCs）定義基因；
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Sorcin是心臟興奮-收縮的關(guān)鍵因子，是OHCs的top?marker基因；
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對(duì)耳聾相關(guān)基因的分析鑒定了迄今未被識(shí)別的外顯子；
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Nanopore長讀長RNA-seq（全長轉(zhuǎn)錄組測(cè)序）揭示剪接多樣性和isoform豐度。
參考文獻(xiàn)：Ranum?P?T,?Goodwin?A?T,?Yoshimura?H,? et?al.?Insights?into?the?Biology?of?Hearing?and?Deafness?Revealed?by? Single-Cell?RNA?Sequencing[J].?Cell?reports,?2019,?26(11):?3160-3171.? e3.
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