上篇文章介紹了高通量測(cè)序后的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證手段，主要介紹了表達(dá)量驗(yàn)證、RNA結(jié)合蛋白、亞細(xì)胞定位。本文從功能方面來對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，功能方面無非就是使感興趣的基因的表達(dá)升高（功能獲得）或降低（功能缺失）看樣品表型是否有變化?；蜻^表達(dá)和基因沉默是研究基因功能的兩個(gè)重要手段。
功能獲得研究
功能獲得：過表達(dá)基因
構(gòu)建克隆，將目的基因連接在特定的載體（可以是慢病毒載體、腺病毒載體、質(zhì)粒）上,在載體上一般含有增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)錄的promoter。將克隆導(dǎo)入表達(dá)細(xì)胞中，即轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染（如果是昆蟲表達(dá)系統(tǒng),構(gòu)建的質(zhì)粒還需要先轉(zhuǎn)座成為桿狀病毒基因組才能用于轉(zhuǎn)染）。轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的外源基因在其上游強(qiáng)啟動(dòng)子的作用下可以直接過量表達(dá)。
功能缺失研究
功能缺失：敲除、敲減、沉默基因表達(dá)
常用的沉默基因表達(dá)方法有，RNA干擾、CCRISPR/Cas9、反義寡核苷酸、位點(diǎn)反轉(zhuǎn)和啟動(dòng)子缺失等方法。可根據(jù)感興趣RNA的亞細(xì)胞定位選擇合適的敲減方法，如RNA干擾作用只作用在胞漿（胞漿+細(xì)胞器=胞質(zhì)）內(nèi)，無法對(duì)細(xì)胞核起作用，此時(shí)siRNA或者shRNA方法可能不適用，需要用其他方式進(jìn)行基因沉默。
反義寡核苷酸（antisense oligonucleotide）是指進(jìn)行了某些化學(xué)修飾的短鏈核酸（約15-25個(gè)核苷酸組成），其堿基順序排列與特定的靶標(biāo)RNA序列互補(bǔ)，進(jìn)入細(xì)胞后可按照Watson-Crick堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則與靶標(biāo)序列形成雙鏈結(jié)構(gòu)。反義寡核苷酸與靶標(biāo)RNA結(jié)合后可抑制靶標(biāo)RNA的表達(dá)。
RNA干擾(RNA interference，RNAi)是指，將與mRNA對(duì)應(yīng)的正義RNA和反義RNA組成的雙鏈RNA(double stranded RNA, dsRNA，與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA)導(dǎo)入細(xì)胞，可以使mRNA發(fā)生特異性的降解，導(dǎo)致其相應(yīng)的基因沉默的現(xiàn)象。這種轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制(post-transcriptional gene silencing, PTGS)被稱為RNAi。
RNAi的實(shí)現(xiàn)有兩種方式，一種是直接購買siRNA寡核苷酸片段，轉(zhuǎn)染到靶細(xì)胞中；另一種是利用shRNA慢病毒載體構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)的細(xì)胞系，shRNA在細(xì)胞中被加工為siRNA，進(jìn)而發(fā)揮RNAi的作用。
CCRISPR/Cas9是一種由RNA指導(dǎo)的，利用Cas9核酸酶對(duì)靶向基因進(jìn)行編輯的技術(shù)。該技術(shù)可方便快捷對(duì)任意基因進(jìn)行編輯改造，比如基因敲除，敲入，定點(diǎn)突變等，不過卻有相當(dāng)?shù)拿摪懈怕?/p>
從哪些方面可以看到基因表達(dá)的變化對(duì)表型造成變化呢，一般都是由淺入深，由細(xì)胞模型到動(dòng)物模型！有了這種驗(yàn)證，想發(fā)低分文章都不能夠！
細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
通過改變?cè)摶蛟诩?xì)胞內(nèi)的表達(dá)，來探討細(xì)胞表型是否會(huì)發(fā)生改變。如細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、遷移侵襲、細(xì)胞粘度、耐藥，還有難一點(diǎn)的血管形成、能量代謝等。
細(xì)胞表型的改變通常進(jìn)行正反兩種實(shí)驗(yàn)，如敲除某基因驗(yàn)證細(xì)胞凋亡時(shí)，做TUNEL實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其凋亡后，還需Rescue實(shí)驗(yàn)將敲除基因重新導(dǎo)入細(xì)胞看是否能挽救表型。
細(xì)胞增殖
CCK-8/CFSE流式法、克隆形成實(shí)驗(yàn)、MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖
細(xì)胞凋亡
流式細(xì)胞術(shù)、Tunel法、Annexin V/PI雙染法，以及細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)檢測(cè)（光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡觀察細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變）
細(xì)胞遷移和侵襲
Transwell
如果用matrigel膠包被transwell小室可以檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力（invasion）；反之，不包被transwell小室檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的遷移能力（migration）。
是不是看不懂，沒事，多看看文獻(xiàn)，做的時(shí)候自然就懂啦……
動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
通過改變關(guān)注基因在動(dòng)物內(nèi)的表達(dá)，來探討動(dòng)物的表型是否會(huì)發(fā)生改變。因此，構(gòu)建模擬人類疾病表型的動(dòng)物模型至關(guān)重要。
醫(yī)學(xué)動(dòng)物模型
- 誘發(fā)性動(dòng)物疾病模型
人為地誘發(fā)動(dòng)物產(chǎn)生類似人類疾病模型
- 自發(fā)性動(dòng)物模型
不加任何人工誘發(fā)，自然條件下自然產(chǎn)生疾病的動(dòng)物。
- 抗疾病型動(dòng)物模型
即特定的疾病不會(huì)在某種動(dòng)物發(fā)生，可研究天然抗性的因素。
- 生物醫(yī)學(xué)動(dòng)物模型
動(dòng)物正常的生物學(xué)特征來提供人類疾病相似表型的疾病模型。
常見腫瘤模型
- 自發(fā)瘤模型
未經(jīng)任何有意識(shí)的人工處理，自然形成腫瘤
- 誘發(fā)瘤模型
利用外源性致癌物引起細(xì)胞遺傳特性改變，從而出現(xiàn)異常生長(zhǎng)活性細(xì)胞，形成腫瘤。常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為大鼠，也有用小鼠、豚鼠、兔、犬等。
- 移植瘤模型
將動(dòng)物或人體腫瘤細(xì)胞/組織移植到動(dòng)物體內(nèi)連續(xù)傳代而形成腫瘤。腫瘤研究中最常用的是裸鼠模型，即建立皮下移植瘤模型（將腫瘤細(xì)胞或腫瘤組織直接種植在小鼠的皮下）。
注：不易成瘤的腫瘤組織一般選擇腫瘤腎被膜下種植移植瘤模型
- 基因組修飾模型
通過在動(dòng)物整體敲除或插入特性的基因而建立的腫瘤模型。
采用所研究的疾病/性狀對(duì)應(yīng)的動(dòng)物模型，對(duì)動(dòng)物模型采用上述技術(shù)對(duì)特定基因進(jìn)行過表達(dá)或沉默處理，接下來去檢測(cè)相應(yīng)的指標(biāo)。如采用NB技術(shù)檢測(cè)相應(yīng)基因的表達(dá)、腫瘤相應(yīng)的生長(zhǎng)曲線、HE檢測(cè)組織的形態(tài)變化等。
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