外顯子測序揭示畸形精子癥男性不育近親家系FBXO43純合突變

近日，蘭州大學基礎醫(yī)學院學者發(fā)表了有關(guān)畸形精子癥男性不育相關(guān)研究，該研究中外顯子測序由百邁客生物科技有限公司完成，詳情如下：

研究方法

1. 形態(tài)學分析：通過透射電子顯微鏡觀察精子形態(tài)異常

2. 全外顯子組測序鑒定候選致病基因：先證者所在近親家系（4例，先證者、先證者弟弟及其父母），突變位點篩選及保守性分析

3. 突變位點驗證：sanger測序驗證篩選后的候選突變位點

4. 預測突變后蛋白結(jié)構(gòu)變化：Swiss-Model蛋白結(jié)構(gòu)建模及可視化

5. 大量散發(fā)樣本驗證：124名患有畸形精子癥的散發(fā)性不育男性患者和200名正常生育的男性對照中進行單個基因靶向測序，篩查散發(fā)病例中的突變

研究結(jié)果

1、患者表型–形態(tài)學分析

本研究中涉及的為甘肅省回族一個近親結(jié)婚家系，其中兩兄弟都沒有孩子，并且患有生育障礙。許多以前的精液分析顯示出嚴重的畸形精子癥。兩兄弟以前沒有重大疾病的記錄，檢查顯示正常的男性血清激素水平，正常的46,XY 核型和Y染色體微缺失。

形態(tài)學分析顯示嚴重的完全畸形精子癥，主要的異常是嚴重的無定形頭，具有空泡和過剩的殘留細胞質(zhì)（圖1F）。來自兩兄弟的精子在頭部出現(xiàn)畸形（圖1G和H）。精子呈現(xiàn)較大的無定形頭和腔隙染色質(zhì)缺陷（空泡），具有豐富的殘留細胞質(zhì)。

2、WES鑒定FBXO43 C1991T純合突變

對兩兄弟及其父母進行了全外顯子組測序WES，平均覆蓋深度為120×，目標區(qū)域覆蓋度為99.87％。排除在任何變異數(shù)據(jù)庫中MAF>0.05的變異，錯義突變、無義突變、移碼突變和剪接位點突變等優(yōu)先保留。此外，SIFT、PolyPhen-2和Mutation Taster等同時預測為具有潛在有害性的變異也被保留用于進一步評估。

由于父母為近親結(jié)婚，首先考慮常染色體隱性遺傳模式，確定了2個具有功能喪失突變或潛在有害的錯義突變位點。結(jié)合基因功能分析等條件過濾后，鎖定了一個新的非同義突變FBXO43（C1991T，p.G664D）。通過Sanger測序，證實了2個兄弟存在FBXO43中的C1991T純合突變。先證者的父母攜帶雜合突變。

3、FBXO43純合突變的保守性和結(jié)構(gòu)功能分析

FBXO43基因C1991T（G664D）純合突變位于5號外顯子（圖2A）。FBXO43蛋白質(zhì)包括?F-box和C-端的ZBR（鋅結(jié)合區(qū)）（http://www.uniprot.org/uniprot/Q4G163）。殘基G664D位于FBXO43蛋白的C端ZBR中（圖2B），殘基G664在Euteleostomi（真硬骨動物）中高度保守（圖2C）。非同義突變G664D不存在于1000G以及ExAC數(shù)據(jù)庫中。此外，SIFT、PolyPhen-2和Mutation Taster預測G664D突變可導致蛋白功能變化（有害）。

（注：該圖中除C1991T（G664D）外，其他突變?yōu)樵谏l(fā)樣本中發(fā)現(xiàn)的FBXO43基因突變）

FBXO43（c.1991C>T）非同義突變導致FBXO43蛋白664殘基從非極性氨基酸（Gly甘氨酸）轉(zhuǎn)變?yōu)閹ж撾姾傻陌被幔ˋsp天冬氨酸）（G664D）。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)通過in silico結(jié)構(gòu)模型預測，與野生型相比，具有2個明顯縮短的β-折疊（殘基654-668）、額外產(chǎn)生的α-螺旋（殘基610-613）和明顯變化的loop（殘基583-618）。

4、散發(fā)樣本FBXO43突變篩查

為了評估更廣泛人群中FBXO43的突變，對散發(fā)不孕患者和未受累對照進行了FBXO43基因突變篩查。所有散發(fā)不孕的患者均為甘肅省漢族人。主要的異常是無定形精子頭，具有可變比例的空泡和過剩的殘留細胞質(zhì)。其他精液參數(shù)因不同患者而異，包括不同的精子濃度水平（41.61±32.48×106/ml）和不同精子活力（45.397％±22.83％）。

在124名散發(fā)患者中有4名（3.2％）攜帶FBXO43雜合突變。這4名患者均出現(xiàn)不孕和畸形精子癥。此外，這些突變也不存在于1000 Genomes Project和ExAC數(shù)據(jù)庫中（表1）。殘基E594、I250、G149和E98在Euteleostomi（真硬骨動物）中也是保守的（圖2C）。

為了排除所鑒定的突變在研究群體中是常見突變的可能性，對來自中國200個可育個體的FBXO43外顯子進行了突變篩查。進行精液分析和生育有后代的200名可育人群均為甘肅省漢族人。然而，在200個對照個體中沒有發(fā)現(xiàn)任何致病性FBXO43突變。

小結(jié)

作者在一個中國近親家庭的2個不育兄弟中發(fā)現(xiàn)了FBXO43基因突變。臨床篩查和遺傳分析結(jié)果支持FBXO43突變可能與以畸形精子癥為特征的男性不育相關(guān)。在臨床ICSI（Intracytoplasmic sperm injection，即卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)）中，精子的質(zhì)量基于形態(tài)學標準，并且在一些不育個體中重復治療失敗的確切原因在很大程度上是未知的。因此，對畸形精子癥的遺傳基礎的研究可能揭示精子發(fā)育背后的其他基因和相應的機制。本研究研究結(jié)果為男性不育的分子診斷提供了候選基因，并擴展了對FBXO43突變的致病作用的認識，需要進一步的研究來探索FBXO43的功能并深入了解畸形精子癥可能的遺傳基礎。

參考文獻：

MA, Ying, et al. A novel homozygous FBXO43 mutation associated with male infertility and teratozoospermia in a consanguineous Chinese family. Fertility and sterility, 2019.

 

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