眾所周知，外泌體在很多生理病理上起著重要的作用，如免疫中抗原呈遞、腫瘤的生長與遷移、組織損傷的修復(fù)等；同時，外泌體與疾病診斷、預(yù)后等密切相關(guān)，因此也可以作為分子標志物；當然，外泌體經(jīng)過一定修飾后，可作為載體將包裹在其內(nèi)的藥物/貨物運送到特定靶標組織或區(qū)域。
下面我們來為大家分別介紹2篇近期發(fā)表的外泌體小RNA測序研究方法，一個方法是為機制機理研究方向，另一外泌體研究方法為分子標志物研究方向。
外泌體研究方法：【文獻一】
該研究由南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院的學(xué)者完成，題目：間充質(zhì)基質(zhì)細胞來源的外泌體通過miR-182調(diào)節(jié)巨噬細胞極化減弱心肌缺血再灌注損傷。
研究背景
間充質(zhì)干細胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）逐漸成為調(diào)節(jié)心臟炎癥的有力候選者，MSCs分泌的外泌體可能是心肌梗死后MSCs移植起作用的新機制。作者探討了MSC來源外泌體（MSC-Exo）在心肌缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）后巨噬細胞免疫調(diào)節(jié)中的作用及其在心臟損傷修復(fù)中的意義。
主要研究方法
使用梯度離心法從MSC的上清液中分離外泌體（MSC-Exo）；
在心肌缺血/再灌注（I/R）之前和之后24小時施用巨噬細胞清除劑-二氯亞甲基二膦酸鹽(Cl2MDP)脂質(zhì)體，再灌注后0h立即遞送MSC-Exo或PBS在至心肌。檢測梗塞面積以及心臟和血清中的炎癥水平等；
流式細胞檢測分析巨噬細胞M1和M2比例；
MSC-Exo miRNA測序分析鑒定巨噬細胞極化的有效候選分子和其靶基因。
研究結(jié)果
在心肌I/R后通過心肌內(nèi)注射給小鼠施用MSC-Exo減少了梗塞面積并減輕了心臟和血清中的炎癥水平；
用巨噬細胞清除劑-二氯亞甲基二膦酸鹽(Cl2MDP)脂質(zhì)體消除了MSC-Exo的療效；
MSC-Exo在體內(nèi)和體外均調(diào)節(jié)促炎的M1巨噬細胞向抗炎的M2巨噬細胞極化；
MSC-Exo-miRNA-seq揭示miR-182可能作為巨噬細胞極化的有效候選介質(zhì)，以及其下游靶基因TLR4。敲低MSC-Exo中miR-182部分減弱其對巨噬細胞極化的調(diào)節(jié)，TLR4的敲低也賦予心肌I/R小鼠模型中的心臟保護功效并降低炎癥水平。
外泌體研究方法：【文獻二】
該研究由中央民族大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院/轉(zhuǎn)化神經(jīng)科學(xué)研究中心負責(zé)人程勇教授領(lǐng)導(dǎo)課題組完成，題目：全基因組整合分析提示精神分裂癥外泌體來源的miRNA失調(diào)。
研究背景
精神分裂癥（schizophrenia，SCZ）風(fēng)險相關(guān)的遺傳變異已經(jīng)被廣泛研究了，但是SCZ相關(guān)的轉(zhuǎn)錄后機制尚未得到很好的研究。并且這些遺傳變異通常是微效的。除遺傳因素外，越來越多的證據(jù)表明表觀遺傳學(xué)可能參與SCZ的發(fā)病機制。已知的表觀遺傳標記中，microRNAs（miRNAs）在過去十年中備受關(guān)注，已被證明在神經(jīng)發(fā)育和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的維持中發(fā)揮關(guān)鍵作用，例如神經(jīng)分化、突觸可塑性和認知功能。以往的研究提示miRNA可作為各種神經(jīng)精神疾病的潛在生物標志物。
方法和結(jié)果
1、miRNA篩選：
血清exo-miRNA-seq，49個第一次發(fā)作未用藥的SCZ患者?vs?46個HC對照；
1）training set：23個SCZ患者?vs?23個HC對照，鑒定高表達（TPM≥10）的、顯著差異表達（FDR<0.05）且差異倍數(shù)較高(FC≥2)DEmiRNAs：hsa-miR-206、hsa-miR-145-5p和hsa-miR-133a-3p。
2）testing set：26個SCZ患者?vs?23個HC對照，鑒定高表達（TPM≥10）的、顯著差異表達（FDR<0.05）且差異倍數(shù)較高(FC≥2)DEmiRNAs共計7個，包括前面training set的3個DE miRNA。
3）pooled set：綜合上述2個set，共計6個miRNA符合上述條件：6 miRNAs (hsa-miR-206、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-133a-3p、hsa-miR-144-5p、hsa-miR-144-3p和hsa-miR-184)。
2、隨機森林分類器鑒定SCZ診斷分子標志物：
使用training set鑒定到一組11個miRNA，其AUC（Area Under Curve）為0.94 (95% CI, 0.88–1.0)，敏感性0.783，特異性0.957。
testing set中驗證該組11個miRNA的敏感性為0.769，特異性為0.783，AUC 為0.753 (95% CI,0.61–0.90）。
3、SCZ外泌體miRNA共表達模塊分析：
上述pooled set（49個SCZ患者?vs?46個HC對照）進行miRNA WGCNA分析，共計鑒定到11個共表達的模塊，其中3個與疾病狀態(tài)顯著相關(guān)。
4、DE miRNA以及SCZ相關(guān)miRNA共表達模塊靶基因通路和功能富集分析：
比如hsa-miR-206，其是SCZ患者的血液外泌體中最顯著上調(diào)的miRNA，并且之前報道其調(diào)節(jié)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF表達。顯著相關(guān)miRNA共表達模塊靶基因顯著富集到了O型聚糖的生物合成等通路，GO富集到了神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白、樹突棘和樹突發(fā)育相關(guān)term。
4、qRT-PCR驗證DEmiRNA表達及其靶基因表達驗證：
qRT-PCR驗證：100個SCZ患者（57例第一次發(fā)作未用藥患者FEDF和43例長期治療患者CT）vs?100個對照對于hsa-miR-206、hsa-miR-144-3p其驗證結(jié)果與二代測序一致，且經(jīng)過長期治療在CT組其水平會向正常組趨近。靶基因表達和elisa結(jié)果顯示SCZ患者血液中BDNF mRNA和蛋白質(zhì)水平降低。greenyellow模塊中靶基因GALNT8和GALNT15也顯著降低。
文獻一：Zhao J, Li X, Hu J, et al. Mesenchymal Stromal Cell-Derived Exosomes Attenuate Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury through miR-182-Regulated Macrophage Polarization[J]. Cardiovascular Research, 2019.
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文獻二：Du Y, Yu Y, Hu Y, et al. Genome-Wide, Integrative Analysis Implicates Exosome-Derived MicroRNA Dysregulation in Schizophrenia[J]. Schizophr Bull. 2019 Feb 16.
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