外泌體小RNA測序揭示成肌細胞外泌體促進成骨分化【成功案例】

C2C12成肌細胞外泌體通過miR-27a-3p促進前成骨細胞MC3T3-E1成骨分化

研究背景

越來越多的證據(jù)表明，骨與肌肉組織可以影響葡萄糖、能量等代謝。最近，已有報道骨骼和肌肉也可以通過內(nèi)分泌方式相互調(diào)節(jié)。并且已確定了一系列參與相互調(diào)節(jié)的肌肉或骨骼調(diào)節(jié)劑。關于影響骨形成的候選肌因子（myokines ），胰島素樣生長因子-1（IGF-1）、成纖維細胞生長因子-2（FGF-2）、骨甘氨酸、FAM5家族、白細胞介素-7（IL-7）、IL-5、鳶尾素、卵泡抑素、骨粘連蛋白和基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）作為成骨促進劑，而肌抑素、轉化生長因子-β（TGF-β）、激活素、IL-6、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子（CNTF）、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）作為抑制劑，都屬于分泌蛋白。

外泌體是由包括肌肉細胞在內(nèi)的大多數(shù)細胞分泌的小囊泡。最近的研究表明，外泌體在細胞通訊中發(fā)揮關鍵作用，通過轉移生物活性分子（蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、mRNA、microRNA）來調(diào)節(jié)同質(zhì)和異質(zhì)受體細胞的功能和分化。例如，作者前期研究表明，成骨細胞衍生的外泌體可以將microRNA載入間充質(zhì)干細胞，并通過激活Wnt信號通路促進靶細胞的成骨。

考慮到外泌體在細胞通訊中的作用，作者推測外泌體microRNAs是否也可以作為調(diào)節(jié)骨代謝的特殊“肌細胞因子”。在這項研究中，作者首次提供體外研究證據(jù)，證明成肌細胞衍生的外泌體可以進入成骨細胞，促進成骨細胞分化。此外表明miR-27a-3p是這種效應的關鍵外泌體成分。

研究方法

• 細胞培養(yǎng)與成骨誘導分化：小鼠C2C12細胞培養(yǎng)富集外泌體，MC3T3-E1被誘導骨分化。
• 外泌體富集及miRNA-seq：C2C12細胞外泌體富集，進行miRNA-seq（n=4）。
• 外泌體標記與MC3T3-E1細胞共孵育：觀察攝入現(xiàn)象。
• 敲低C2C12中 miR-27a-3p表達，進行RT-PCR定量。
• RT-PCR定量成骨分化標記基因，ALP（堿性磷酸酶）活性測量和茜素紅染色。
• MC3T3-E1 Western blot及免疫熒光：驗證APC及β-catenin活化。

研究結果

1、C2C12成肌細胞分泌的外泌體可以進入前成骨細胞MC3T3-E1，促進其成骨分化。

將外泌體標記與MC3T3-E1共孵育，觀察到這類外泌體（myo-exosomes）能夠被MC3T3-E1細胞攝入。并且MC3T3-E1細胞的成骨分化也能夠被促進，表現(xiàn)為增強的ALP活性，基質(zhì)礦化增強，與標記基因ALP/OCN/RUNX2表達上調(diào)。對C2C12成肌細胞分泌的外泌體進行小RNA測序，基于測序結果，鑒定出來的miRNA進行共有分析，其中有12個miRNA分子高表達，一些功能被證實的與成骨相關的miRNA分子，例如miR-27a-3p也包括在內(nèi)。

2、外泌體的miR-27a-3p在成骨分化中發(fā)揮重要作用。

當MC3T3-E1細胞攝入C2C12外泌體后，miR-27a-3p的表達水平升高。進一步敲低miR-27a-3p的表達，C2C12外泌體沒有起到促進MC3T3-E1成骨分化的作用。這一結果表明了成肌細胞外泌體依賴于miR-27a-3p發(fā)揮促成骨作用。

3、C2C12外泌體改變 MC3T3-E1細胞中miR-27a-3p的表達，靶向APC從而激活Wnt/β-catenin pathway。

在成骨分化過程中，Wnt/β-catenin pathway起到重要作用，APC作為該通路的負調(diào)節(jié)蛋白已被證實直接受miR-27a-3p調(diào)控。MC3T3-E1攝入外泌體后，APC的表達受到明顯抑制，β-catenin的表達顯著升高且被激活。當miR-27a-3p敲低后，外泌體對APC-β-catenin pathway沒有影響。

總結

成肌細胞外泌體可以進入前成骨細胞，并促進成骨分化。該效應依賴于外泌體中的miR-27a-3p釋放，隨之引起前成骨細胞中的β-catenin通路活化。文章研究對肌因子調(diào)控肌肉-骨互作提供了新見解，并且強調(diào)了成肌細胞外泌體miR-27a-3p作為肌肉相關的異常骨重建的指標和互作靶標的可能性。

參考文獻：

Xu Q, Cui Y , Luan J , et al. Exosomes from C2C12 myoblasts enhance osteogenic differentiation of MC3T3-E1 pre-osteoblasts by delivering miR-27a-3p. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2018.

 

如果您的項目有任何問題，歡迎聯(lián)系我們，我們將給您滿意的答復。