DNA甲基化是表觀遺傳的經(jīng)典修飾方式，其并不改變基因的堿基序列，而是通過改變基因的表達影響細胞的功能，在調控基因表達、維持染色質結構、基因印記、X染色體失活以及胚胎發(fā)育等生物學過程中發(fā)揮著重大的作用。DNA 甲基化的形式多種多樣，主要包括 C5-甲基胞嘧啶（5mC）、N6-甲基腺嘌呤（6mA）等。
目前市場常用重亞硫酸鹽法檢測5mC，其√確度高，但化學處理會導致DNA分子的片段化、測序深度高、無法鑒定更多修飾類型。Nanopore技術作為新一代基于納米孔的單分子實時電信號測序技術，截至目前，全球范圍內基于Nanopore平臺進行的甲基化研究文章近10篇，見刊于nature methods、bioRxiv等國際知名期刊。
ONT甲基化測序流程
不同于傳統(tǒng)的甲基化檢測方法，使用ONT平臺進行測序前，不需要再對DNA樣本進行化學處理，避免了人為因素和化學因素的影響。具體步驟如下：
1、提取高質量基因組 DNA，利用Nanodrop、Qubit 和35% 瓊脂糖凝膠電泳進行純度、濃度和完整性質檢；
2、將基因組DNA打斷成平均8kb左右；
3、使用SQK-LSK109連接試劑盒（ONT官方試劑）進行文庫構建，包括DNA 損傷修復和末端修復、接頭連接、磁珠純化等；
4、使用Qubit 進行文庫定量。
? ? ? ? 圖1 甲基化建庫流程? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 圖2 ONT 電信號識別
待文庫構建完成后，就可進行上機測序。 ONT 測序是新一代基于納米孔的單分子實時電信號測序技術，由于 DNA 鏈上不同堿基化學性質存在差異，所以當單個堿基通過納米孔通道時，會產(chǎn)生不同的電信號，而當存在堿基修飾時，同一位置的電信號也會有所差別?；诖?，軟件則將這些電信號進行識別，判讀為不同的修飾信息。
ONT甲基化的優(yōu)勢?
?單堿基水平檢測，無中間處理，不擴增、不富集，真實還原堿基修飾信息
?測序讀長長，避免短讀長帶來的拼接比對錯誤，鑒定z確
?鑒定種類豐富，5mC、6mA多種堿基修飾一次搞定，性價比高
?可進行等位基因特異性甲基化檢測
?ONT 甲基化成功案例
使用ONT平臺進行甲基化研究可謂日漸火熱，截至目前，已經(jīng)有十多篇文章發(fā)表，研究學者的熱情日益高漲。百邁客將目前見刊的文章給大家進行了匯總，方便查閱
自從2017年開啟ONT平臺研發(fā)立項，百邁客不斷探索與前進，經(jīng)過一年多時間的沉淀與磨礪，百邁客Nanopore測序技術已經(jīng)逐步成熟并且達到穩(wěn)定狀態(tài)。截至目前，百邁客已擁有3臺ONT PromethION，并建立超過上百種物種類型的文庫，擁有大量的項目經(jīng)驗！無論是技術還是項目經(jīng)驗上，都實力過硬！
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