【大豆灰斑病】基因組測(cè)序揭示尾孢霉在大豆中的潛在致病機(jī)制

題目：Genome sequencing and comparativegenomics reveal the?potential?pathogenic mechanism of Cercospora sojina Hara onsoybean
雜志名稱：DNA? RESEARCH
影響因子：5.415
合作單位：中國(guó)科學(xué)院等

研究背景

材料方法

2、基因組測(cè)序和組裝：
二代（Illumina），270bp文庫(kù)，90 x +?三代（PacBio）10kb文庫(kù)，123x

3、基因組注釋:
將所有預(yù)測(cè)的基因用數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行功能注釋，數(shù)據(jù)庫(kù)為：Swiss-Prot、NR、KEGG、COG、Pfam、HMMER、GO、PHIbase。

4、重復(fù)序列和全基因組DNA甲基化分析
使用TandemRepeats Finder（TrF）鑒定串聯(lián)重復(fù)序列。使用三種軟件Repeat Modeler、Repeat Protein Masker和Repeat Masker嚴(yán)格挖掘轉(zhuǎn)座因子（TE）。

5、系統(tǒng)發(fā)育分析和共線性分析、碳水化合物活性成分的比較分析、次級(jí)代謝產(chǎn)物的提取和定量

6、轉(zhuǎn)錄組分析和定量RT-PCR：

7、推定效應(yīng)子的功能研究
將推定的效應(yīng)基因克隆到由35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的二元載體pMD-1中。通過電穿孔將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化到根癌土壤桿菌菌株EHA105中。使用含有指示效應(yīng)物的EHA105菌株滲入4周齡本塞姆氏煙草葉無針注射器。GFP和Phytophothorasojae效應(yīng)子Avr1b分別作為陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。二十四小時(shí)后，用EHA105滲透植物攜帶pVX-BAX。

研究結(jié)果

1、C. sojina基因組的組裝

像大多數(shù)真菌一樣，C. sojina表現(xiàn)出類似的感染周期，但它也表現(xiàn)出一些區(qū)別（圖S1）。它不形成附著物，但分枝菌絲能通過開放氣孔感染植物（圖S1C和D）。與其他半營(yíng)養(yǎng)真菌相比，F(xiàn)LS疾病發(fā)展相對(duì)較慢（圖S1C）。Kmer峰圖顯示該菌為單核真菌。（圖S2）

使用CANU從頭組裝測(cè)序數(shù)據(jù)（4,920,479,113bp clean reas），N50長(zhǎng)度為1.59Mb，總組裝大小約為40.84Mb（表1）。通過circos-plot顯示了24個(gè)最大的支架（圖1）。預(yù)測(cè)共11,655個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因，其基因密度為每1 Mb約285個(gè)基因。在基因組中預(yù)測(cè)了277個(gè)tRNA和281個(gè)假基因。RNA-seq數(shù)據(jù)顯示有8,474個(gè)推定的蛋白質(zhì)編碼基因。

Figure1. Circos-plotof?C. sojina.

2、重復(fù)序列和潛在的甲基化位點(diǎn)

重復(fù)DNA序列和TEs在真菌的進(jìn)化，基因組結(jié)構(gòu)和基因功能中起重要作用。在C.sojina基因組中鑒定了總共11,138,239bp（11M）重復(fù)序列，包括DNA轉(zhuǎn)座子，LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，串聯(lián)重復(fù)序列和其他未分類的轉(zhuǎn)座子（圖2A）。重復(fù)序列占基因組的25.56％。大多數(shù)重復(fù)序列（96.36％）是TE，而串聯(lián)重復(fù)序列僅占0.93％。DNA轉(zhuǎn)座子和LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子分別占所有TE的28％和25％。

DNA甲基化涉及許多重要的細(xì)胞過程，例如基因組印記和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控。雖然已經(jīng)在高等植物和動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)DNA甲基化多年，但最近在一些真菌中也有相關(guān)報(bào)道。使用SMRT能夠檢測(cè)到m6A和m4C甲基化。在C.sojina基因組中共鑒定了1,015,733m4C（4-甲基?-胞嘧啶）和17,409m6A（6-甲基?-腺苷）（圖2B）。大多數(shù)分類的DNA甲基化是m4C，占98.3％，而m6A僅占1.7％。然而，與m6A相比，m4CDNA甲基化在重復(fù)元件的區(qū)域中出現(xiàn)低頻率較低（圖2C-E）。

Figure2. Repeatelements and DNA methylation sites of?C.sojina.

3、比較基因組分析

利用一組真菌的系統(tǒng)發(fā)育骨架基因分析了C. sojina和其他真菌物種的進(jìn)化關(guān)系。系統(tǒng)發(fā)育分析表明C. sojina在進(jìn)化上接近于尾孢菌（Cercospora zeae-maydis），一種可引起玉米葉斑病的植物病原體（圖3A）。此外，C. sojina也接近其他三個(gè)病原體Pseudocercospora fijiensis，Sphaerulina musiva和Dothistroma septosporum（圖3A）。

Figure 3.Phylogenetic and synteny analysis of?C. sojina?with other fungal species.

4.分泌組織和潛在的效應(yīng)器

? ? ? C. sojina的基因組包含11,655個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因，覆蓋約41％的基因組序列。最豐富的結(jié)構(gòu)域是PF14295.4（n = 6），其介導(dǎo)蛋白質(zhì)?–?蛋白質(zhì)相互作用。其他常見結(jié)構(gòu)域包括abhydrolase域（PF12697.5，n5），水解酶域（PF12146.6，n = 5）和PAN域（PF00024.24，n = 5）。

5.通過全基因組轉(zhuǎn)錄分析上調(diào)致病相關(guān)基因

由于C.sojina對(duì)大豆的感染進(jìn)展非常緩慢，難以收集足夠的樣本來檢查植物菌絲的基因表達(dá)。饑餓治療可以模仿感染期間病原體的生理學(xué)。因此，使用生長(zhǎng)24和48小時(shí)的菌絲體，并通過RNA測(cè)序進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析;分別在饑餓處理后24小時(shí)和48小時(shí)鑒定出3,227和3,223個(gè)差異表達(dá)的基因（DEG）。四類DEG引起了我們的注意，這些基因注釋為參與PHI，分泌蛋白組，推定的碳水化合物活性酶（CAZymes）和次級(jí)代謝過程。

6.基因簇用于次級(jí)代謝物

尾孢菌（Cercosporasojina）基因組編碼16個(gè)非核糖體肽合成酶（NRPS），20?個(gè)PKS，18個(gè)脂肪酸合成酶，3個(gè)萜烯合酶，2?個(gè)geranylgeranyl二磷酸合成酶和1種萜類化合物環(huán)化酶。這些酶參與次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成，包括霉菌毒素，色素和生物堿。在C. sojina基因組中鑒定了一個(gè)具有8個(gè)尾孢菌素生物合成基因的類似基因簇。（圖4A）。這八個(gè)基因顯示高氨基酸序列與煙草（C. nicotianae）尾孢菌素生物合成基因的相似性在相同的串聯(lián)順序中（圖4A）。此外，我們觀察到感染期間8種基因的轉(zhuǎn)錄增加（圖4B）。

Figure 4. Putative gene clusters forcercosporin biosynthesis in?C. sojina.

? ? ? 色素是成功入侵病原體的另一組次要代謝物。通常，病原體產(chǎn)生的色素能夠在感染期間保護(hù)病原體免受宿主氧化應(yīng)激。C.sojina基因組編碼多個(gè)推定的PKS，其負(fù)責(zé)色素產(chǎn)生（圖5A）。C.sojina還可產(chǎn)生一些灰色色素，并且通過饑餓和cAMP處理顯著誘導(dǎo)色素（圖5B），表明色素可能與病原體毒力有關(guān)。因此，進(jìn)一步分離和部分純化了色素。得到灰色，淺黃色和深灰色三種色素，深灰色是最豐富的色素。

Figure 5. PutativePKS gene clusters for pigment production in?C.sojina.

7.碳水化合物活性酶

成熟的植物致病真菌可以分解并利用CAZymes的植物細(xì)胞壁多糖。尾孢菌（Cercospora sojina）含有596個(gè)預(yù)測(cè)的CAZymes。與其他真菌相比，C.sojina具有更大的潛在碳水化合物酯酶組，其可催化取代糖的N-去酰化。在C. sojina基因組中，有大約23.5％的潛在分泌蛋白被預(yù)測(cè)為CAZyme，證明C.sojina可能在入侵期間使用大量CAZymes來消化宿主細(xì)胞壁。有趣的是，其中一個(gè)CAZymes家族，即糖苷水解酶GH109家族，是高度富集的（圖6）。

Figure 6. Comparison of carbohydrateenzymes between?C. sojina?and nine other fungal species.

8.推定效應(yīng)子的功能分析

效應(yīng)器是由細(xì)菌，卵菌或真菌分泌的低分子量蛋白質(zhì)，其損害宿主免疫防御并適應(yīng)特定環(huán)境。在玉米病原體U.maydis中，觀察到分泌的蛋白質(zhì)編碼基因簇中的大多數(shù)基因在感染組織中同時(shí)被誘導(dǎo)。233個(gè)推定效應(yīng)子的系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，21個(gè)預(yù)測(cè)的效應(yīng)子被分組成在C.sojina中含有2或3個(gè)高序列相似性基因的簇（圖7A）。假定的效應(yīng)子群集也表明局部重復(fù)可能參與了C.sojina中效應(yīng)子的擴(kuò)增。另外，40個(gè)推定的效應(yīng)器可以通過PHI數(shù)據(jù)庫(kù)注釋，并且大多數(shù)注釋的效應(yīng)子與真菌發(fā)病機(jī)理有關(guān)。

因此，我們嘗試研究效應(yīng)器功能。促凋亡小鼠蛋白BAX誘導(dǎo)的本氏煙草程序性細(xì)胞死亡（PCD）在生理上可能與病原體引起的防御相關(guān)的過敏反應(yīng)相似，提供了有價(jià)值的篩查可以抑制與防御相關(guān)的PCD的效應(yīng)物的方法。我們隨機(jī)選擇50個(gè)效應(yīng)子并在本塞姆氏煙草中瞬時(shí)表達(dá)它們以篩選可以抑制BAX觸發(fā)的PCD（BT-PCD）的潛在效應(yīng)物。結(jié)果表明，約1/4選擇的效應(yīng)子強(qiáng)烈抑制BT-PCD（圖7B）。此外，qRT-PCR結(jié)果顯示，大多數(shù)這些推定的效應(yīng)子在C.sojina感染后48小時(shí)被轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)（圖7C），這意味著它們可能有助于大豆灰斑病的早期感染。

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