2018年11月14日中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所谷曉峰研究團(tuán)隊(duì)與百邁客共同合作研究項(xiàng)目“N6-MethyladenineDNA Methylation in?Japonica?and?Indica?Rice Genomes and Its Associationwith Gene Expression, Plant Development and Stress Responses”在雜志Molecular Plant上在線發(fā)表！通訊作者為谷曉峰研究員。谷老師是中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所研究員，博士生導(dǎo)師。圍繞發(fā)育和產(chǎn)量開(kāi)展表觀遺傳學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)多個(gè)通過(guò)RNA修飾、DNA甲基化、組蛋白修飾等機(jī)制調(diào)控生育期的新機(jī)制。在Molecular Cell、Developmental Cell、PLoSBiology等國(guó)際學(xué)術(shù)期刊上發(fā)表文章20余篇。
英文題目：N6-Methyladenine DNA Methylation in?Japonica?and?Indica?Rice Genomes and Its Association with? ?Gene Expression, Plant Development and Stress Responses
中文題目：粳稻和秈稻基因組N6-甲基腺嘌呤DNA甲基化及其與基因表達(dá)、植物生長(zhǎng)和應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)系
發(fā)表雜志：Molecular Plant
影響因子：9.326
發(fā)表時(shí)間：2018.11.14
合作單位：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所
研究背景
N6-甲基腺嘌呤（6mA）是在真核生物和原核生物中發(fā)現(xiàn)的豐富的DNA修飾之一，6mA的研究主要集中在其在原核生物中的功能。近年來(lái)，動(dòng)物真菌擬南芥和綠藻的研究開(kāi)始揭示6mA甲基化的全基因組模式及其在真核細(xì)胞中調(diào)節(jié)基因表達(dá)的作用。6mA在植物中的生物學(xué)功能在很大程度上是未知的，水稻是世界上重要的作物之一，也是分子和遺傳學(xué)研究的模式物種，以擴(kuò)展我們?cè)谥参镏?mA的知識(shí)。
研究材料
粳稻日本晴栽培種Japonica?Nipponbare (Nip) ；秈稻栽培種?Indica?93-11
研究方法
Denovo：PacBio RSII （Nip：117X；93-11：116X）；Illumina （Nip：129X；93-11：41X）
Dot blot 分析；LC-MS/MS分析；6mA-IP-Seq；6mA-IP-qPCR；6mA-RE-qPCR；RNA-seq（IlluminaHiSeq X-ten）； PacBioSMRT檢測(cè)6mA；CRISPR-Cas9誘變。
研究結(jié)果
LC-MS/MS結(jié)果顯示水稻幼苗的6mA含量在0.15%～0.55%之間,與小麥、玉米、高粱、小米及苜蓿相當(dāng)。通過(guò)SMRT（單分子實(shí)時(shí)測(cè)序系統(tǒng)Single MoleculeReal Time）測(cè)序數(shù)據(jù)，在Nip和93-11中分別檢測(cè)出704875個(gè)和784912個(gè)6mA位點(diǎn)（每條鏈的覆蓋率≥25，質(zhì)量值≥20）。超過(guò)90 %的6mA – IP – seq峰與至少一個(gè)由SMRT測(cè)序鑒定的6mA位點(diǎn)重疊，此外，6mA – IP – qPCR分析分別獨(dú)立驗(yàn)證了從Nip和93- 11的12條染色體中隨機(jī)選擇的48個(gè)陽(yáng)性和24個(gè)陰性基因座。甲基化水平高的位點(diǎn)顯示高富集度，而甲基化水平低的位點(diǎn)顯示低富集度。使用6mA-RE-qPCR驗(yàn)證了帶有CATG motif的10個(gè)陽(yáng)性和2個(gè)陰性的隨機(jī)選擇的基因組。表示了SMRT技術(shù)在6mA檢測(cè)中的可靠性。
Circos圖顯示Nip和93-11的12條染色體中廣泛分布6mA位點(diǎn)。6mA位點(diǎn)在染色體臂中部富集，尤其在著絲粒周?chē)惾旧|(zhì)區(qū)域附近富集，在染色體末端附近6mA密度較低。在未甲基化的腺嘌呤中，沒(méi)有觀察到這種模式，這表明基因組范圍的6mA分布在水稻基因組中不是隨機(jī)的。Nip(ANCBA)和93-11(ANMGA)豐富的motif在兩端含有兩個(gè)保守的腺嘌呤，在中間含有一個(gè)胞嘧啶，類(lèi)似于擬南芥的6mA motif。而第二個(gè)富集的motif類(lèi)似于在秀麗隱桿線蟲(chóng)中鑒定的6mA motif（GAGG）（圖2）。
? Nip和93-11的6mA甲基化基因
RNA-seq分析表明在Nip和93-11中，在6mA位點(diǎn)有大量的高表達(dá)基因甲基化，大量未甲基化基因在低水平表達(dá)。6mA甲基化基因的表達(dá)水平顯著高于非6mA基因，并且高表達(dá)基因顯示出較高的6mA占用率，特別是在啟動(dòng)子和基因體區(qū)域中包含6mA位點(diǎn)的基因。6mA與水稻中的活性表達(dá)基因有關(guān)。5mC在水稻基因組中高豐度存在，影響基因表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)5mC和6mA之間沒(méi)有相關(guān)性（圖4）。
? 水稻Nip、93-11和擬南芥6mA甲基體的比較
粳稻和秈稻對(duì)環(huán)境脅迫有不同的耐受性。Nip對(duì)冷和鹽脅迫表現(xiàn)出更大的耐受性，而93-11對(duì)熱脅迫表現(xiàn)出更大的耐受性。用LC-MS/MS分別研究了Nip和93-11幼苗在冷脅迫、熱脅迫和鹽脅迫下的DNA甲基化動(dòng)力學(xué)，并探討了脅迫反應(yīng)差異的潛在表觀遺傳學(xué)基礎(chǔ)。6mA水平在低溫脅迫下明顯降低，在高溫或鹽脅迫下顯著增加，而5mC水平保持穩(wěn)定。6mA水平的變化在Nip和93-11之間表現(xiàn)出顯著的差異。水稻6mA含量與耐冷性呈負(fù)相關(guān)，與耐鹽性和耐熱性呈正相關(guān)（圖6）。
根據(jù)SMRT測(cè)序結(jié)果，篩選出候選的6mA修飾的熱脅迫相關(guān)基因，如熱休克轉(zhuǎn)錄因子A1（HsfA1）和熱休克蛋白70（HSP70）。HSFA1是熱脅迫反應(yīng)的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，其在非脅迫條件下受到HSP70的抑制。HSFA1功能缺失導(dǎo)致熱脅迫敏感表型。HsfA1和HSP70表達(dá)的變化與其6mA水平的變化呈正相關(guān)，這可能是Nip和93-11之間熱脅迫耐受性差異的原因。
水稻基因組含有兩個(gè)DDM1同源基因DDM1a和DDM1b，由于功能冗余，只有T-DNA插入單突變體產(chǎn)生的雙突變體DDM1a/1b表現(xiàn)出發(fā)育表型。然而，DDM1a/1b不產(chǎn)生活花粉，導(dǎo)致種子呈空殼和深色。用CRISPR-Cas9對(duì)Nip背景中的DDM1a和DDM1b進(jìn)行了有針對(duì)性的誘變，并鑒定了10個(gè)獨(dú)立的T1系用于DDM1a、DDM1b單突變和4個(gè)獨(dú)立的DDM1a/DDM1b(1a/1b)雙突變型。在任何不同類(lèi)型的DDM1a或DDM1b純合子單突變體中均未觀察到表型。與野生型植物相比，所有純合1a/1b系表現(xiàn)出相同的矮化表型。1a-1/1b-1顯示出降低的結(jié)實(shí)率，而另外3個(gè)雙突變體顯示不育。LC-MS/MS對(duì)DNA甲基化水平的定量測(cè)量顯示6mA水平顯著降低，但1a/1b植物中5mC水平變化不大。6mA-IPqPCR分析顯示，6mA水平在大多數(shù)隨機(jī)選擇的位點(diǎn)中顯著降低。RNA-seq結(jié)果表明野生型中6mA修飾基因的表達(dá)水平顯著高于1a-1/1b-1植物中的相同基因，野生型中非6mA基因與1a-1/1b-1植物中的相應(yīng)基因之間沒(méi)有表達(dá)水平差異。結(jié)果表明6mA水平與基因表達(dá)呈正相關(guān)。
6mA-IP-qPCR證實(shí)了野生型植物SMRT測(cè)序鑒定的6mA位點(diǎn)，1a-1/1b-1植物中6mA水平顯著降低。結(jié)果表明，抽穗期7（GHD7）、BR-缺陷矮稈1（BRD1）和DWF7的表達(dá)水平與其DDMa介導(dǎo)的6mA修飾相關(guān)（圖7）。
總結(jié)
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