英文題目：Enteric dysbiosis-linked gut barrier disruption triggers early renal injury induced by chronic high salt feeding in mice
中文題目：小鼠慢性高鹽喂養(yǎng)誘導(dǎo)的與腸道生態(tài)失調(diào)相關(guān)的腸道屏障破壞引起早期腎損傷
發(fā)表雜志：Experimental & Molecular Medicine
影響因子：5.063
合作單位：南方醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)系
01.研究背景
高血壓的患病率不斷增加，正在成為世界各地的主要公共衛(wèi)生問題。高血壓的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。慢性高鹽飲食相關(guān)的腎損傷是高血壓發(fā)展的關(guān)鍵風(fēng)險因素。然而，高鹽攝入引發(fā)腎臟損害的機(jī)制知之甚少。
暴露于食用鹽的第一個器官是腸道。腸道異常（包括腸道生態(tài)失調(diào)和腸道通透性增加）與許多腸外疾病有關(guān)。例如，飲酒可誘發(fā)腸道生態(tài)失調(diào)，并可破壞腸道屏障完整性，從而使病原體相關(guān)分子滲入血液并轉(zhuǎn)移至肝臟，導(dǎo)致肝臟脂肪變性和進(jìn)一步酒精性肝炎?；谶@一理論，作者旨在研究高鹽攝取是否能夠直接破壞腸內(nèi)穩(wěn)態(tài)，并反過來引發(fā)早期腎損傷。
02.研究方法
1、取材：
? 6-8周齡雄性無病原體的C57BL / 6小鼠
? 飲用水中添加2％NaCl，連續(xù)飼喂小鼠8周，以誘導(dǎo)早期腎損傷
? 對于抗生素實(shí)驗(yàn)，將多粘菌素B（150mg / l）和新霉素（200mg / l）連續(xù)添加到NaCl飲用水中喂食8周
2、測序
? 糞便樣本（盲腸內(nèi)容物）或回腸/結(jié)腸粘膜層分離細(xì)菌——16S測序
? 回腸和結(jié)腸組織——轉(zhuǎn)錄組測序
03.研究結(jié)果
1、慢性高鹽攝入導(dǎo)致腸道生態(tài)失調(diào)
慢性高鹽HS喂養(yǎng)后，盲腸中的總細(xì)菌負(fù)荷略微降低。分離不同部位的菌群，慢性HS喂養(yǎng)后，回腸上皮和結(jié)腸腔內(nèi)的細(xì)菌負(fù)荷也降低。
慢性HS處理顯著降低厚壁菌門水平，并提高擬桿菌門的水平，這表明菌群組成在HS攝入后發(fā)生改變。
16S rRNA測序表明， HS組的盲腸內(nèi)容物（cecal content）菌群組成與對照小鼠相比，在門和綱水平上明顯不同。特別是在HS處理后，盲腸內(nèi)容物中放線菌門和厚壁菌門中的Actinobacteria、Firmicutes和Bacteroidetes以及綱水平中的Actinobacteria，Clostridia和Bacteroidia所占比例顯著改變。使用未加權(quán)的uniFrac分析的主坐標(biāo)分析（PCoA）顯示，HS組和對照組盲腸內(nèi)容物菌群分別聚類（P = 0.002，ADONIS分析）。粘膜細(xì)菌也是影響腸道病理生理狀態(tài)的重要因素，回腸粘膜（ ileal mucosa）和結(jié)腸粘膜（colonic mucosa）在整個胃腸道中的細(xì)菌數(shù)量最多。因此，進(jìn)一步分析了位于回腸粘膜層和結(jié)腸粘膜層的細(xì)菌。未加權(quán)的uniFrac分析顯示，HS組和對照組在回腸粘液層分別聚類（P = 0.014，ADONIS分析）。而在結(jié)腸粘液層，對照組和HS組也形成兩個聚類類別，分離趨勢明顯（P =0.05，ADONIS分析）。
2、慢性高鹽喂養(yǎng)導(dǎo)致以炎性反應(yīng)受損為特征的腸道異常
對照組和HS喂養(yǎng)組小鼠的回腸和結(jié)腸上皮形態(tài)無明顯差異，同時，慢性HS喂養(yǎng)不影響腸中的細(xì)胞死亡。炎癥標(biāo)志物的表達(dá)隨著慢性HS攝入發(fā)生顯著改變。特別是，Ccl4、Ccl5和IFN-γ在HS小鼠的回腸中表現(xiàn)出更高的mRNA表達(dá)水平?；啬c中IFN-γ免疫組織化學(xué)的結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了這一基因表達(dá)數(shù)據(jù)。由于TLR家族蛋白和Nf-κB是參與病原體相關(guān)免疫反應(yīng)的主要分子，作者進(jìn)一步評估了TLR家族和Nf-κB基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)TLR2、TLR3和TLR5 在回腸中趨于更高的mRNA表達(dá)水平。HS處理后IRF7、GATA3和NFKB2的表達(dá)顯著上調(diào)。HS喂養(yǎng)后，回腸中CD38的表達(dá)升高。
通過二代測序進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析，比較對照組和HS組之間涉及“細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用”、“NF-κB信號通路”和“Toll樣受體信號通路”的所有相關(guān)基因的表達(dá)。結(jié)果表明回腸和結(jié)腸中，兩組之間許多基因的表達(dá)存在差異。
3、慢性高鹽攝入導(dǎo)致腸道屏障功能喪失，并促進(jìn)細(xì)菌移植進(jìn)入腎臟
通過糞便白蛋白含量檢測腸通透性，結(jié)果顯示HS喂養(yǎng)促進(jìn)腸道滲漏。同時，HS攝入顯著降低結(jié)腸中的tjp-1、tjp-2、claudin-1、claudin-7和claudin-8基因表達(dá)。此外，與對照小鼠相比，HS攝入后，回腸和結(jié)腸中形成屏障的緊密連接ZO-1蛋白的表達(dá)水平顯著降低以及結(jié)腸中的Occludin蛋白顯示出顯著較低的趨勢。另一方面，在HS喂養(yǎng)后，回腸和結(jié)腸中“成孔”緊密連接蛋白Claudin-2蛋白的表達(dá)顯著升高。這些數(shù)據(jù)清楚地表明腸道屏障被慢性HS攝入所破壞。
腸道通透性增加可能導(dǎo)致腸道細(xì)菌或細(xì)菌產(chǎn)物易位至腸外組織。通過使用16s PCR來識別細(xì)菌DNA，檢測腎臟、肝臟和脾臟中的細(xì)菌易位。有趣的是，慢性HS攝入促進(jìn)了細(xì)菌易位進(jìn)入腎臟，但不會進(jìn)入肝臟或脾臟。LEfSe試驗(yàn)結(jié)果表明，與對照組相比，HS處理的腎臟中富含屬于腸道細(xì)菌的桿菌。與對照動物的腎臟相比，在HS喂養(yǎng)的腎臟中，芽孢桿菌（Bacillus）和游動微菌（Planomicrobium）分別增加了2.6倍和8.7倍。
4、慢性高鹽喂養(yǎng)相關(guān)的腸道屏障破壞和腎損傷取決于腸道微生物菌群
給予小鼠抗生素（多粘菌素B和新霉素，antibiotics，ABX）處理后，恢復(fù)了HS喂養(yǎng)誘導(dǎo)的回腸IFN-γ的過表達(dá)和腸道滲漏。通過尿和血漿Na +濃度測量，發(fā)現(xiàn)抗生素并不改變鈉負(fù)荷。HS喂養(yǎng)增加了血漿肌酐（creatinine）水平，與HS治療相比，抗生素治療后具有較低但不顯著的血漿肌酐水平。HS喂養(yǎng)小鼠的腎功能障礙主要標(biāo)志物–尿白蛋白/肌酐比率顯著增加，但抗生素治療幾乎可以完全恢復(fù)腎功能?？股厥┯眠€可以降低HS誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞升高。以上結(jié)果表明，抗生素治療能夠改善HS喂養(yǎng)引起的腸道滲漏和早期腎損傷。
5、慢性高鹽喂養(yǎng)引起的收縮壓升高取決于腸道微生物菌群
慢性HS喂養(yǎng)可能導(dǎo)致動脈壓升高。 雖然HS處理的小鼠的舒張壓（DBP）和平均血壓沒有增加，但收縮壓（SBP）在慢性HS喂養(yǎng)后顯著升高。有趣的是，抗生素治療能夠完全恢復(fù)正常SBP。這些數(shù)據(jù)強(qiáng)烈表明，慢性HS喂養(yǎng)引起的SBP升高取決于腸道微生物菌群。
6、慢性高鹽處理的小鼠的腸道微生物菌群可以獨(dú)立地引起腸道泄漏和早期腎損傷
糞便微生物菌群移植實(shí)驗(yàn)：喂食正常飲食的兩組小鼠口服來自對照和HS處理的小鼠的糞便。移植8周后，接受對照糞便的對照小鼠中的微生物菌群組成改變的主要標(biāo)記物–盲腸厚壁菌/擬桿菌比例明顯高于接受HS糞便的小鼠，這一點(diǎn)與作者之前的數(shù)據(jù)一致，表明HS喂養(yǎng)會降低盲腸中的厚壁菌 / 擬桿菌比例，并說明了糞便微生物菌群移植實(shí)驗(yàn)是成功的。給藥4周后，糞便白蛋白含量檢測結(jié)果表明，接受HS喂養(yǎng)糞便的小鼠的腸通透性顯著增加。并且，尿白蛋白（albumin）/肌酸酐(creatinine)比率（在當(dāng)前研究中觀察到的腎功能障礙的主要表型），在移植4周后接受HS喂養(yǎng)的糞便的小鼠中也顯著增加。最后，與對照小鼠相比，HS糞便移植小鼠中的腎臟凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著增加。
小 結(jié)
該研究通過使用依賴于微生物菌群的“腸-腎軸”理論為研究鹽相關(guān)性高血壓的發(fā)病機(jī)制提供了新方向。未來的工作將重點(diǎn)關(guān)注腸道細(xì)菌與鹽誘導(dǎo)的高血壓的發(fā)病之間的聯(lián)系，將詳細(xì)說明細(xì)菌的應(yīng)答或細(xì)菌中的代謝途徑，這些細(xì)菌參與并促進(jìn)由鹽誘導(dǎo)的腸道和腎臟病理變化，并且此文中在“腸-腎軸”中的新發(fā)現(xiàn)將提供潛在的高血壓干預(yù)治療目標(biāo)。
參考文獻(xiàn)
Hu, Jingjuan, et al. “Enteric dysbiosis-linked gut barrier disruption triggers early renal injury induced by chronic high salt feeding in mice.” Experimental & molecular medicine 49.8 (2017): e370.
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