一文帶你get Hi-C研究套路

背景介紹

DNA在染色體上是高度折疊的，DNA與DNA片段之間不可避免的形成了高強度的交互作用。2002年提出的3C技術(shù)，用于測定染色體特定位點與位點之間的交互作用，隨后發(fā)展出4C、5C 技術(shù)，分別用于測定染色體上一點到多點和多點與多點之間的交互作用。Job Dekker在2009年開發(fā)出Hi-C 技術(shù)，實現(xiàn)了全基因組范圍內(nèi)染色體片段間相互作用的捕獲。Hi-C 除了用于輔助基因組組裝、對已組裝的基因組進行糾錯，還可以揭示基因組的三維結(jié)構(gòu)特征，包括從隔室（A/B Compartments）到拓撲相關(guān)結(jié)構(gòu)域（TAD），最后到染色體環(huán)（loop），目前，已在人、果蠅、酵母、擬南芥、水稻和棉花等物種成功構(gòu)建基因組三維結(jié)構(gòu)，并完成了對不同樣本基因組三維結(jié)構(gòu)的比較分析。

1、Hi-C三維構(gòu)象研究內(nèi)容

1）繪制全基因組的Hi-C map、Cis/Trans和IDEs等分析；
2）Compartment A/B 鑒定與分析，包括與ChIP-seq、WGBS和RNAseq等聯(lián)合分析；
3）TAD鑒定與分析，包括與ChIP-seq、WGBS和RNAseq等聯(lián)合分析；
4）繪制全基因組LOOP模型圖，需DNase-seq或ATAC-seq，并與ChIP-seq和RNAseq聯(lián)合分析；
5）多樣本三維結(jié)構(gòu)差異分析，包括Compartment A/B、TAD和Loop差異鑒定與分析；
6）基因/重復(fù)序列互作分析，包括與RNAseq聯(lián)合分析。

圖1 染色體不同層級三維構(gòu)象圖
（Fraser J, et al, 2015）

2、染色體三維結(jié)構(gòu)重點研究內(nèi)容

A/B compartments

高等動植物基因組可以人為劃分為兩個compartments，稱作A/B compartments，通過計算PCA，第一主成分中正值表示A compartment，負值表示B compartment。A/B compartments在基因組中一般呈間隔分布，A compartments呈松散染色質(zhì)狀態(tài)，基因密度高，屬于轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)域，而B compartments則呈壓縮染色質(zhì)狀態(tài)，基因密度低，屬于轉(zhuǎn)錄抑制區(qū)域。通過對多個樣本A/B compartments 的分布進行對比，在全基因組水平找出A/B compartments保守的區(qū)域以及發(fā)生A/B compartments轉(zhuǎn)換的區(qū)域，結(jié)合RNA-Seq對發(fā)生A/B compartments轉(zhuǎn)換區(qū)域內(nèi)的基因的表達量進行統(tǒng)計，有助于解釋不同樣本間的差異與染色質(zhì)活性狀態(tài)之間的關(guān)系。如圖2：

圖2 人正常細胞和癌癥細胞A/B compartments
（Wu P, et al, 2017）

例如在人的多發(fā)性骨髓瘤文章中，作者利用正常B細胞（GM12878）和兩種亞型的骨髓瘤細胞（近二倍體U266和近三倍體RPMI-8226）進行Hi-C、WGS和RNA-seq測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比于GM12878，U266和RPMI-8226癌癥細胞中6%的區(qū)域均存在B轉(zhuǎn)換到A，1%的區(qū)域均存在A轉(zhuǎn)換到B，結(jié)合RNA-seq數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)B轉(zhuǎn)換到A區(qū)域內(nèi)的基因變成轉(zhuǎn)錄活躍狀態(tài)，而A轉(zhuǎn)換到B區(qū)域內(nèi)的基因變成轉(zhuǎn)錄抑制狀態(tài)，KEGG富集通路發(fā)現(xiàn)這些基因與多發(fā)性骨髓瘤相關(guān)，主要涉及MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、TNF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、細胞因子和細胞因子受體相互作用途徑等，進一步在染色體2q11.2-q12.142處發(fā)現(xiàn)一個細胞因子基因簇，幾種白細胞介素IL1R1，IL1R2，IL18R1和細胞因子MAP4K4下調(diào)表達，這些基因在后續(xù)研究中重點關(guān)注。

?TAD?

TAD（拓撲關(guān)聯(lián)結(jié)構(gòu)域）是一個高度自關(guān)聯(lián)的連續(xù)區(qū)域，通過明顯的邊界與相鄰區(qū)域分離開來，形成一個獨立的調(diào)控單元，內(nèi)部的基因擁有共同的調(diào)控元件，存在協(xié)同表達特征。TAD邊界通常具有大量的絕緣子蛋白和黏連蛋白（植物中TAD邊界一般缺少絕緣蛋白，邊界不明顯），對于維持TAD結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定性具有重要作用，不但可以指導(dǎo)染色體折疊成高級結(jié)構(gòu)，還可以正確指導(dǎo)遠距離轉(zhuǎn)錄調(diào)控，該邊界發(fā)生變化會導(dǎo)致基因調(diào)控變得紊亂。TAD邊界還與組蛋白修飾、甲基化修飾等密切相關(guān)，通常與轉(zhuǎn)錄活性相關(guān)的表觀遺傳標(biāo)記富集在TAD邊界，而與轉(zhuǎn)錄失活相關(guān)的表觀遺傳標(biāo)記遠離TAD邊界。通過對多個樣本TAD進行對比，在全基因組水平找出發(fā)生變化的TAD（重點關(guān)注TAD邊界），結(jié)合ChIP-seq、WGBS等分析TAD的變化是否與表觀遺傳修飾相關(guān)，進一步利用RNA-Seq對相關(guān)基因的表達量進行統(tǒng)計，有助于解釋不同樣本間空間結(jié)構(gòu)的差異與表觀遺傳修飾及轉(zhuǎn)錄調(diào)控之間的關(guān)系。如圖3：

圖3 不同種棉花TAD邊界及表觀遺傳修飾
（Wang M, et al, 2018）

例如，在棉花的三維基因組進化文章中，作者對二倍體雷蒙德氏棉、二倍體亞洲棉、四倍體陸地棉和四倍體海島棉構(gòu)建了三維基因組圖譜，與雷蒙德氏棉D(zhuǎn)03染色體相比，陸地棉和海島棉對應(yīng)的Ｄ亞基因組中發(fā)生了染色質(zhì)重排，虛線對應(yīng)的TAD結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，雷蒙德氏棉中該TAD結(jié)構(gòu)完整，存在明顯的邊界，陸地棉中該邊界發(fā)生了左移，而海島棉中該TAD趨向于消失。因而通過鑒定TAD發(fā)生變化區(qū)域的基因，可以研究多倍化過程中基因表達調(diào)控的改變（研究多倍體的老師們，這可是一個很好的套路文章哦）。同時結(jié)合ChIP-seq數(shù)據(jù)對該TAD邊界進行分析發(fā)現(xiàn)，雷蒙德氏棉富含豐富的H3K4me3（活性染色質(zhì)標(biāo)記），而陸地棉和海島棉中H3K4me3顯著減少，說明在棉花的多倍化與表觀遺傳修飾存在密切關(guān)聯(lián)。

Loop?

Loop（染色質(zhì)環(huán)）將線性距離很遠的位點拉至空間距離很近，在Hi-C圖譜中表現(xiàn)為峰值位點（peak loci），該peak位點通常一端為啟動子，另一端為增強子，Loop將啟動子和增強子拉至空間很近的距離，從而調(diào)控基因的表達，存在這種loop（啟動子-增強子環(huán)）相關(guān)基因的表達量將幾倍甚至幾十倍的增加。loop通常與DNAase-seq或者ATAC-seq結(jié)合使用（特異性識別啟動子），從而鑒定啟動子-增強子環(huán)。通過對多個樣本Loop進行對比，在全基因組水平找出發(fā)生變化的Loop，結(jié)RNA-Seq對相關(guān)基因的表達量進行統(tǒng)計，有助于解釋不同樣本間loop及基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控之間的關(guān)系。如圖4：

圖4 人不同細胞loop（Rao S S.P. , et al, 2014）

例如，在人的loop文章中，作者在GM12878細胞系發(fā)現(xiàn)9448個loop，其中2854個loop與已知的啟動子-增強子作用相關(guān)，基因的啟動子存在loop比不存在loop時的表達量顯著增加。GM12878細胞系中存在一個Loop，這個Loop連接了SELL啟動子和一個遠端增強子SELP，基因開啟轉(zhuǎn)錄，表達量增加，而IMR90細胞系中沒有這個Loop，基因不表達。

3、百邁客Hi-C研究優(yōu)勢

百邁客自2016年初以來，利用Hi-C技術(shù)進行染色體水平的基因組組裝及染色體三維構(gòu)象的研究，成功開發(fā)出六堿基、四堿基酶切方案，組裝、互作輕松拿下。在植物Hi-C領(lǐng)域，更是邁進了一大步，在同行還只能處理植物活體樣本的時候，我們已經(jīng)可以輕松“駕馭”離體枝條，感覺一大波離體枝條在向小編招手~

迄今為止，保持著近100%的建庫成功率，積累了大量植物、動物（哺乳動物、昆蟲、水生動物等）、微生物等的項目經(jīng)驗。植物一次建庫成功率在97%以上，很多物種對應(yīng)文庫的Valid Interaction Pairs(%)值在80%以上，最高達92.61%；動物樣品文庫的Valid Interaction Pairs(%)平均值在60%，最高達86.68%；真菌樣品文庫的Valid Interaction Pairs(%)平均值在72%，最高達84.6%。2018，百邁客Hi-C服務(wù)平臺將繼續(xù)為您的科學(xué)研究保駕護航！如果您Hi-C測序技術(shù)感興趣，歡迎點擊下方按鈕聯(lián)系我們，我們將免費為您設(shè)計文章思路方案。