英文名：High-Throughput Data of Circular RNA Profiles in Human Temporal Cortex Tissue Reveals Novel Insights into Temporal Lobe Epilepsy
中文名：人類顳葉皮層組織的circRNA高通量測序揭示顳葉癲癇的新認知
雜志：Cell Physiol Biochem 2018
影響因子：5.104
合作單位：首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院北京神經(jīng)外科研究所
01.研究背景
癲癇是一種常見的慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，影響近5000萬人，約占世界人口的0.4-1%。顳葉癲癇(TLE)是一種常見的癲癇，伴有藥物抵抗，需要對癲癇灶進行手術切除。人類的TLE病變包括了在鉤回、杏仁核和側顳葉皮層的異常，其中許多異常與興奮性離子通道和改變的離子型受體有關。全基因組表達譜揭示了在人的TLE組織中，離子通道和相關受體基因的模式發(fā)生了顯著的改變，但是這些基因表達如何被調(diào)控仍然未知。
最近的基因組學研究揭示了許多與各種疾病的基因調(diào)控相關的非編碼RNA (ncRNAs)。人類癲癇中非編碼RNA的表達也發(fā)生了改變，可以作為一種新的、非侵入性的生物標志物來改善目前的癲癇診斷。環(huán)狀RNA (circRNAs)是一種獨特的非編碼環(huán)狀RNA，circRNA與microRNAs (miRNAs)相互作用，并作為miRNA海綿，通過circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中調(diào)節(jié)基因表達。研究表明環(huán)狀RNA在神經(jīng)元功能中發(fā)揮重要作用，尤其是在突觸中。組織學研究結果證實，邊緣系統(tǒng)的突觸重組似乎能逐漸增強皮質(zhì)興奮性，并可能導致癲癇發(fā)作。然而，circRNAs在癲癇中的作用仍是未知的。
在本研究中，為了評估circRNA在人體內(nèi)的作用，作者采用了高通量測序方法，測定TLE患者和非TLE患者顳葉新皮質(zhì)中circRNA表達水平，并對環(huán)狀RNA的功能進行了注釋。作者描述了一個包含潛在基因與circRNA-miRNA的網(wǎng)絡。
02.材料方法
試驗材料：非TLE對照組和TLE組患者的顳葉新皮質(zhì)組織
測序方法：circRNA seq，Illumina HiSeq4000（北京百邁客）
03.研究結果
1.臨床和病理數(shù)據(jù)
術中腦電圖（I-EEG）和免疫染色（NeuN和GFAP）結果表明，相比于非TLE對照組，TLE組患者具有典型的異常情況。
圖1. I-EEG和免疫染色結果
2.顳葉皮層circRNA表達譜
在兩組樣本中檢測出了78983個circRNA，15.29%為已知circRNA，84.71%是新發(fā)現(xiàn)的circRNA。其中，58558個circRNA位于外顯子區(qū)，10520個位于內(nèi)含子區(qū)，其它位于基因間區(qū)（圖2a），不同類型circRNA的表達水平如圖2b所示。已知的circRNA整體表達水平比新circRNA高，外顯子circRNA表達水平高于內(nèi)含子和基因間區(qū)的circRNA表達水平。表明樣本中大多數(shù)circRNA位于外顯子區(qū)，并且可能在癲癇中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。
所有circRNA和外顯子circRNA的GC含量高于circRNA數(shù)據(jù)庫，但內(nèi)含子和基因間區(qū)circRNA的GC含量與circRNA數(shù)據(jù)庫中相似（圖2c）。此外，circRNA長度的峰值主要集中在558 bp區(qū)域，而在數(shù)據(jù)庫中circRNA的峰值則集中在4105 bp區(qū)域。新circRNA與已知的circRNA長度具有相似的特征，表明新circRNA數(shù)據(jù)是可靠的（圖2d）。圖2e顯示了circRNA在人類染色體上的基因分布，circRNA也廣泛分布于所有的染色體中，但在Y染色體和著絲粒上的分布較少，在每條染色體的染色體臂兩端有較高的分布。
圖2. CircRNA表達譜
3.CircRNA差異表達分析及qPCR驗證
TLE與對照樣本之間有442個顯著差異表達的circRNA (FC≥2，F(xiàn)DR≤0.05)，其中254個下調(diào)，188個上調(diào)（圖3a）。circRNA的來源基因功能注釋結果表明，這些差異表達circRNA可能與GTPase活性、蛋白轉運和蛋白磷酸化等途徑有關，這些途徑在癲癇的發(fā)病機制中起著關鍵作用。為了找出功能性的差異表達circRNA，比較了100個差異表達最顯著的circRNA和GO數(shù)據(jù)庫中的5058個功能基因，從中找到了10個與神經(jīng)功能相關的circRNAs 。
作者選擇了10個顯著差異表達的circRNA進行qPCR驗證，其中有8個circRNA差異顯著。結果表明，qPCR試驗結果與高通量測序結果基本一致。此外，還選擇了表達量差異最顯著的兩個circRNA（circ-EFCAB2、circa-DROSHA），在28個臨床樣本中進行qPCR試驗（圖3c），結果表明這兩個circRNA在對照組和TLE組之間顯著差異表達。綜上所示，發(fā)現(xiàn)了circ-EFCAB2和circ-DROSHA在TLE患者顳葉皮層組織中存在著異常調(diào)節(jié)。circ-EFCAB2和circ-DROSHA的來源基因分別為EFCAB2和DROSHA。EFCAB基因家族主要選擇性地與鈣離子非共價作用。EFCAB2上調(diào)會影響鈣離子的結合，從而導致癲癇的發(fā)生。DROSHA是一種雙鏈RNA特異內(nèi)切核糖核酸酶，它影響miRNA生物合成的初始階段，其丟失會導致神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)異常、癲癇和神經(jīng)退行性疾病。因此，circ-EFCAB2和circ-DROSHA可能是通過調(diào)節(jié)EFCAB2和DROSHA參與TLE。
圖3. 差異表達circRNA及其來源基因注釋、qPCR驗證
4.circRNA作為miRNA海綿參與癲癇發(fā)病的分子機制
為了確定circ-EFCAB2和circ-DROSHA的功能，利用TargetScan和Miranda來預測靶向miRNA。預測結果表明，circ-EFCAB2的前5個靶向miRNA分別為miR-5787、mir – 684 -5p、miR-3929、miR-6780a-5p和miR-4739，而circ-DROSHA的靶向miRNA分別為miR-1252-5p、miR-651-3p、miR-4446-5p、miR-548ab和miR-4762-3p。通過靶基因預測，找到了上述的10個miRNAs對應的靶基因，構建了circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡（圖4）。其中，circ-DROSHA的間接靶基因CLCN6是一種氯離子通道家族（CLCs）成員，它與電興奮性、跨上皮轉運、電中性和離子穩(wěn)態(tài)等多種生理過程有關；而其打分最高的靶向miR-1252-5p所對應的靶基因ATP1A2與癲癇具有很強的相關性，也是人類癲癇的候選基因。
由于circ-EFCAB2和circ-DROSHA被預測為這些miRNA的海綿，它們可能會吸附這些miRNA而影響靶基因的表達，從而影響TLE的發(fā)病機制。
圖4. circ-EFCAB2、circ-DROSHA調(diào)控網(wǎng)絡
由于circ-EFCAB2和circ-DROSHA被預測為這些miRNA的海綿，它們可能會吸收這些miRNA而影響靶基因的表達，從而影響TLE的發(fā)病機制。
總結
綜上所述，作者對TLE患者顳葉新皮質(zhì)組織的circRNA表達譜進行了全面的分析，確定了癲癇患者的8個circRNA。其中顯著差異表達的circ-EFCAB2和circ-DROSHA可能是通過調(diào)節(jié)來源基于EFCAB2和DROSHA參與TLE，也可能作為miRNA的海綿影響靶基因的表達，參與TLE的發(fā)病機制（圖5）。
圖5. circ-EFCAB2、circ-DROSHA參與癲癇發(fā)生的分子機制示意圖
參考文獻：Li J, Lin H, Sun Z, et al. High-Throughput Data of Circular RNA Profiles in Human Temporal Cortex Tissue Reveals Novel Insights into Temporal Lobe Epilepsy[J]. Cellular Physiology and Biochemistry, 2018, 45(2): 677-691.
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