核酸（nucleic acid）在生物界中堪稱主宰，是一類非常重要的生物大分子，它在生物的繁衍、發(fā)育、維持、衰老和死亡等一切生命活動(dòng)中扮演著重要的角色，如果其結(jié)構(gòu)出現(xiàn)稍許的變動(dòng)，比如一個(gè)堿基的差錯(cuò)、缺失或增加，就有可能導(dǎo)致突變、缺陷或疾病的出現(xiàn)，所以核酸已成為生物化學(xué)、遺傳學(xué)以及其他有關(guān)生命學(xué)科的熱門研究課題，其覆蓋面之廣、進(jìn)展之速為其他學(xué)科所望塵莫及。而進(jìn)行核酸研究的第一個(gè)前提就是能夠?qū)⒑怂釓谋姸嗉姺睆?fù)雜的生物大分子中提取出來，并純化到一定程度，以便進(jìn)行相應(yīng)的科學(xué)研究和實(shí)際應(yīng)用。
核酸，快到“管”里來共分六期，通過此系列與大家分享核酸提取樣品制備、提取方法及檢測(cè)方面的知識(shí)，以期能夠?qū)Υ蠹业目蒲杏兴鶐椭?/p>
1.全血樣品
01.采血管選擇
采集血液進(jìn)行檢測(cè)面臨的一個(gè)主要問題就是細(xì)胞內(nèi)RNA的不穩(wěn)定性，RNA在采血后數(shù)小時(shí)內(nèi)便會(huì)迅速降解。此外，某些種屬的RNA在采血后會(huì)通過基因誘導(dǎo)在體外增加。體外RNA降解和基因誘導(dǎo)均可導(dǎo)致體內(nèi)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄本數(shù)目低估或高估。
BD公司的PAXgene血液RNA管內(nèi)含能夠穩(wěn)定體內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄性狀的添加劑，它能夠減少體外RNA的降解，并將基因誘導(dǎo)的水平降低到最小程度，適用于人和靈長(zhǎng)類動(dòng)物全血樣品制備，對(duì)于全血樣品，我們只推薦使用此管送樣。
BD PAXgene血液RNA管（貨號(hào)762165）
02.采集血液
使用PAXgene血液RNA管前請(qǐng)仔細(xì)閱讀產(chǎn)品說明書，以便進(jìn)行正確的操作。如果PAXgene血液RNA管為唯一的抽血管，則將血液抽入PAXgene血液RNA管之前應(yīng)先抽血入“廢棄管”內(nèi)，使抽血過程中所用的采血器內(nèi)能被血液預(yù)灌注；否則PAXgene血液RNA管應(yīng)為抽血程序中的最后一只試管。確保血液已停止流入試管再?gòu)某轴樒魃先∠略嚬埽≒AXgene血液RNA管內(nèi)的負(fù)壓設(shè)計(jì)可向管內(nèi)抽2.5ml的血）。
采血后應(yīng)立即將PAXgene血液RNA管輕輕地顛倒8-10次，以確保管內(nèi)保護(hù)劑和血液充分混合均勻。
03.保存、運(yùn)輸
將PAXgene血液RNA管豎直置于室溫（18-25℃）靜置2-24小時(shí)，之后可貯藏于-20℃或更低溫度；若試管要貯藏于低于-20℃的溫度，先在-20℃冷凍24小時(shí)，然后再將其轉(zhuǎn)移到-70℃或-80℃，可保存至少50個(gè)月。大體積干冰運(yùn)輸。
2.血清血漿樣品
由于細(xì)胞內(nèi)含有的RNA的豐度遠(yuǎn)高于血液中游離的RNA，即使極少量細(xì)胞的存在也會(huì)對(duì)血液中游離RNA的分析造成很大影響。故去除細(xì)胞和細(xì)胞碎片的污染是血清血漿樣品制備過程的關(guān)鍵。
01.采血管選擇
對(duì)于血清樣品，使用普通血清真空采血管即可；對(duì)于血漿樣品，推薦使用EDTA抗凝管，禁止使用肝素類抗凝管。
02.血漿樣品的分離、保存
使用EDTA抗凝管采集血液樣品（采集后的血液樣品可置于室溫或4℃短暫保存，但不得超過1h）。1900g（或3000rpm），4℃，離心10min。小心轉(zhuǎn)移上層血漿（黃色）至新的1.5ml離心管中，槍頭不要觸碰中間層（白細(xì)胞和血小板層）。一般情況下，10ml的血液可分離出4-5ml血漿。將分離出的血漿16000g，4℃，離心10min。槍頭不要觸碰到管底一側(cè)的雜質(zhì)，小心轉(zhuǎn)移上清到一個(gè)新的1.5ml離心管中，-80℃保存。大體積干冰運(yùn)輸。
血漿樣品分離
03.血清樣品的分離、保存
使用含凝血激活劑的采血管或普通真空采血管采集血液樣品，室溫靜置10-60min使血液凝集。1900g（或3000rpm），4℃，離心10min。小心轉(zhuǎn)移上層血清（黃色）至新的1.5ml離心管中，槍頭不要觸碰中間層（白細(xì)胞和血小板層）。一般情況下，10ml的血液可分離出3-5ml血清。將分離出的血清16000g，4℃，離心10min。槍頭不要觸碰到管底一側(cè)的雜質(zhì)，小心轉(zhuǎn)移上清到一個(gè)新的1.5ml離心管中，-80℃保存。大體積干冰運(yùn)輸。
血清樣品分離
3.細(xì)胞上清
使用合適的容器收集細(xì)胞培養(yǎng)液或其他生物液體。3000g，4℃，離心15min。小心轉(zhuǎn)移上清液至新的無菌離心管中。將分離出的細(xì)胞上清液16000g，4℃，離心10min。槍頭不要觸碰到管底一側(cè)的雜質(zhì)，小心轉(zhuǎn)移上清到新的無菌離心管中，-80℃保存。大體積干冰運(yùn)輸。
細(xì)胞上清分離
4.外泌體樣品
對(duì)于老師自己富集好的外泌體，需要將外泌體溶解在不大于100ul RNase-free的PBS中并充分混勻，以方便后面提取。外泌體樣品溶液置于-80℃保存。大體積干冰運(yùn)輸。
5.組織樣
用于提取RNA的醫(yī)口組織樣，如果樣品量較小，建議優(yōu)先選擇保護(hù)液（RNAlater等）送樣方式。
方案一、保護(hù)液送樣（RNAlater等）
用解剖刀將新鮮組織切成長(zhǎng)寬高均≤0.5 cm的樣本，小器官如鼠肝、腎和脾可以完整的保存在RNAlater中。將組織樣本浸入5-10倍體積的 RNAlater中，以使組織完全浸沒。將樣本置于4℃孵育過夜（以使 RNAlater 完全滲透組織），然后轉(zhuǎn)移至-80 ℃長(zhǎng)期保存。大體積干冰運(yùn)輸。
方案二、液氮速凍送樣
取下新鮮組織，立即剔除結(jié)締組織和脂肪組織等非研究所需的組織類型，如果組織體積較大，應(yīng)盡量將組織切成長(zhǎng)寬高均≤0.5 cm 的小塊（即黃豆大?。?。迅速用預(yù)冷的PBS溶液（RNase free）或生理鹽水將組織表面的殘留血液沖洗干凈。將處理好的組織樣本混合均勻后保存于旋蓋的液氮預(yù)冷凍存管中。迅速置于液氮中冷凍約3h，然后轉(zhuǎn)移至-80 ℃長(zhǎng)期保存。大體積干冰運(yùn)輸。
注意事項(xiàng)：
1.對(duì)于RNA類項(xiàng)目的癌癥樣品，我們建議手術(shù)取下的組織迅速放入RNAlater中，4℃孵育24小時(shí)，然后棄掉RNAlater，切下壞死區(qū)的組織以及癌旁組織，轉(zhuǎn)入旋蓋的液氮預(yù)冷凍存管中，液氮速凍，-80℃保存，干冰運(yùn)輸。
2.組織樣品離開活體后，建議在3min內(nèi)進(jìn)行液氮速凍，速凍前操作時(shí)間越長(zhǎng)，RNA降解的可能性越大。
3.組織樣不建議使用TRIzol送樣，如必須，需充分液氮研磨后溶于適量TRIzol中，組織樣品切勿過量，常溫裂解5min后，-80低溫凍存，干冰運(yùn)輸。
6.細(xì)胞樣品
一次RNA提取反應(yīng)所需細(xì)胞數(shù)≤1×10^7個(gè)，以3×10^6—1×10^7個(gè)為宜。樣品量較大的話，建議按上述要求將細(xì)胞樣品分裝至不同的管中。
01.貼壁細(xì)胞
從培養(yǎng)箱中取出貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞，顯微鏡下觀察細(xì)胞，確定生長(zhǎng)狀態(tài)良好（正常細(xì)胞融合度在80 %左右）。棄去培養(yǎng)基，向細(xì)胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中加入5mL PBS（RNase-free，室溫）洗一次。棄盡PBS，加入適量TRIzol，反復(fù)吸打數(shù)次；直至看不見成團(tuán)的細(xì)胞塊，使之充分溶解于裂解液中形成清亮不粘稠的液體。將裂解好的細(xì)胞溶液轉(zhuǎn)移至 1.5 mL 旋蓋離心管（ RNase-free ）中，置于-80 ℃長(zhǎng)期保存，大體積干冰運(yùn)輸。
02.懸浮細(xì)胞
首先要確定細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好；離心得到細(xì)胞沉淀（依據(jù)客戶實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞離心步驟，注意細(xì)胞離心要適度，不要使細(xì)胞離心過實(shí)而造成裂解液不能充分滲透）。棄去培養(yǎng)基，加入 1 mL PBS（RNase free，室溫），輕輕將細(xì)胞沉淀懸起， 轉(zhuǎn)移至2 mL 旋蓋尖底離心管（RNase free）中。離心（依據(jù)客戶實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞離心步驟，注意細(xì)胞離心要適度，不要使細(xì)胞離心過實(shí)而造成裂解液不能充分滲透）得到細(xì)胞沉淀，棄去PBS，加入適量TRIzol中，反復(fù)吸打數(shù)次，直至看不見成團(tuán)的細(xì)胞塊，使之充分溶解于裂解液中。置于-80 ℃長(zhǎng)期保存，大體積干冰運(yùn)輸。
注意事項(xiàng)：
1.如果是DNA項(xiàng)目普通滅菌PBS清洗即可，如果是RNA項(xiàng)目必須是RNAse-free的。
2.獲取細(xì)胞不建議用胰蛋白酶處理，胰酶為蛋白，如果有殘留的話會(huì)影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
3.細(xì)胞數(shù)量低于5×105建議速凍直接送樣（不用裂解液裂解），由于細(xì)胞數(shù)少，我們會(huì)安排微量提取。
4.細(xì)胞類樣品不建議保存于RNAlater類組織RNA保護(hù)液中送樣，因?yàn)镽NAlater密度大，保存于其中的細(xì)胞難于再離心收集用于提取。
本篇完結(jié)，有才的小編突發(fā)奇想，愿以本篇軟文的角度賦詩(shī)一首，送給有緣的你：
你看，或者不看我
我就在這里
不來不去
你懂，或者不懂我
我就在這里
不悲不喜
我愿意住進(jìn)你的心里
默然，相助
悄然，歡喜
愿你科研順利
分子實(shí)驗(yàn)中心 畢經(jīng)德 | 文案
吳爽 | 審核
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