動(dòng)物測(cè)序樣品怎么做？動(dòng)物樣品制備和運(yùn)輸指南

 

1、前言

1.1適用范圍

本指南介紹百邁客動(dòng)物類(lèi)組織&核酸樣品的送樣要求及制備方法。采集送樣前請(qǐng)?jiān)敿?xì)閱讀。信息單中樣本名稱(chēng)、組織部位必須與實(shí)物相符，避免因信息單與實(shí)物不符導(dǎo)致反復(fù)核對(duì)，影響樣本質(zhì)量、錄入周期，導(dǎo)致提取核酸質(zhì)量不滿(mǎn)足建庫(kù)測(cè)序要求，實(shí)驗(yàn)周期過(guò)長(zhǎng)等

1.2聲明

對(duì)于危害程度為第一、二類(lèi)的高致病性樣品，只接收提取后的核酸樣品，不接收組織樣。對(duì)于危害程度為三、四類(lèi)的致病性或傳染性的組織樣，必須先通過(guò)銷(xiāo)售或運(yùn)營(yíng)與醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)負(fù)責(zé)人溝通，確認(rèn)無(wú)高致病和傳染性且能進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)后再安排樣品寄送。危害程度的判定標(biāo)準(zhǔn)具體參見(jiàn)《人間傳染的病原微生物名錄》

1.3提取風(fēng)險(xiǎn)提示

核酸提取質(zhì)量與物種及組織部位、樣本制備、樣本交接、提取方法與操作、以及環(huán)境等因素息息相關(guān)，尤其是三代超長(zhǎng)提取對(duì)樣的要求更高。組織提取時(shí)可能受到上下游處理操作的影響，因此較難保證單次提取滿(mǎn)足質(zhì)量要求，望老師知悉理解，并做好組織備份。為保障獲得相對(duì)較高質(zhì)量的核酸，請(qǐng)老師務(wù)必按照以下指導(dǎo)原則準(zhǔn)備樣本。對(duì)于珍貴樣本或微量樣本，建議自行提取

2、組織送樣量要求

注意：未在表格出現(xiàn)的物種，請(qǐng)單獨(dú)溝通。送樣量結(jié)果展示為滿(mǎn)足提取一次的量，如樣品經(jīng)過(guò)特殊處理或樣本狀態(tài)異常有幾率影響得率，為了保證您的實(shí)驗(yàn)可以順利進(jìn)行，請(qǐng)酌情增加送樣量

2.1常規(guī)動(dòng)物類(lèi)組織送樣要求

2.2動(dòng)物類(lèi)血液送樣量

2.3動(dòng)物類(lèi)細(xì)胞送樣量

3、核酸送樣要求

1)核酸送樣需要提供相關(guān)檢測(cè)結(jié)果，DNA類(lèi)核酸可提供以下檢測(cè)手段中的一種或多種檢測(cè)結(jié)果： Qubit、 NanoDrop、 AGE，同時(shí)請(qǐng)采取適當(dāng)?shù)募兓椒?，以避免多糖、多酚、蛋白或者核酸酶?duì)DNA樣品的污染，并詳細(xì)注明溶解DNA所使用的溶解液類(lèi)型

2)如果您開(kāi)展的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目為miRNA的相關(guān)實(shí)驗(yàn)，并且提供的是總RNA的樣本，請(qǐng)務(wù)必確認(rèn)您采用的總RNA的提取方法保留了小RNA （ 包括miRNA），提取試劑盒型號(hào)備注送樣信息單中

3.1二代DNA送樣量要求

3.2三代DNA送樣量要求

3.3RNA類(lèi)送樣量要求

1)針對(duì)核酸有雜質(zhì)、污染、粘稠、顏色等情況，需要過(guò)柱純化后送樣或者酌情增加送樣量

2)核酸樣品建議使用1.5ml、2ml EP管裝載樣品，其他保存管容易破裂且不利于保存樣品和后續(xù)實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展

3)為了防止樣品污染和混淆，禁止使用96孔板和深孔板裝載樣品

4)用乙醇沉淀的樣品由于運(yùn)輸中會(huì)有少量乙醇揮發(fā)，建議將樣品管蓋用封口膜纏繞4-5圈

5)考慮到核酸可能存在含有雜質(zhì)、顏色等物質(zhì)導(dǎo)致會(huì)產(chǎn)生大量損失的風(fēng)險(xiǎn)，為保證樣本一次檢測(cè)合格并節(jié)約寶貴的重送樣時(shí)間，送樣建議量是高于公司判定標(biāo)準(zhǔn)的，請(qǐng)?jiān)诤怂崃孔銐虻那疤嵯卤M量按

4、樣品制備保存指南

4.1常規(guī)動(dòng)物類(lèi)樣本（脊柱動(dòng)物、哺乳動(dòng)物）

常規(guī)動(dòng)物主要包括脊椎動(dòng)物組織樣本主要包括：哺乳動(dòng)物、禽類(lèi)、爬行動(dòng)物以及兩棲動(dòng)物。送樣需要選擇新鮮采集的樣本，尤其是Ultra long ONT建庫(kù)，樣本的取材優(yōu)先選擇核酸含量相對(duì)較高的組織，樣本制備優(yōu)先級(jí)：血液>內(nèi)臟>肌肉?；铙w取下新鮮組織（肌肉、肝臟或其他組織，避免用易于寄生微生物的表皮和腸道、可能有變異細(xì)胞的病變組織），立即剔除結(jié)締組織和脂肪組織等非研究所需的組織類(lèi)型。對(duì)腫瘤組織的取材，應(yīng)盡可能準(zhǔn)確地判定腫瘤和正常組織，腫瘤組織應(yīng)將周?chē)恼＝M織切除干凈（正常組織也應(yīng)將周?chē)哪[瘤組織切除干凈），腸道組織一定要把內(nèi)容物清洗干凈

4.1.1液氮速凍組織操作流程（所有產(chǎn)品適用）

1)提前準(zhǔn)備好冷凍組織的足量液氮，預(yù)裝樣品的凍存管，并在做好標(biāo)記（盡量不使用漢字命名，命名字符控制在5個(gè)以?xún)?nèi)）

2)活體取下新鮮的組織

3)迅速用預(yù)冷的PBS溶液（RNase free）或0.9%生理鹽水將組織表面的殘留血液沖洗干凈

4)如果組織體積較大，將組織切成長(zhǎng)寬高均≤0.5 mm 的小塊（即黃豆大?。?/p>

5)將凍處理好的組織樣本混合均勻后保存于2 mL 或更大體積的螺口凍存管（RNase free）中，標(biāo)注編號(hào)

6)立即（20s內(nèi)）置于液氮中冷凍 3~4 h，然后轉(zhuǎn)移至-80 °C長(zhǎng)期保存

7)干冰運(yùn)輸

4.1.2TRIzol保存樣品制備流程（僅RNA細(xì)胞組織適用）

1)如果使用 TRIzol裂解液保存送樣，請(qǐng)務(wù)必先進(jìn)行液氮研磨破碎，樣品量取參考標(biāo)準(zhǔn)送樣量的1/3，然后溶于 TRIzol 中，組織樣品切勿過(guò)量

2)震蕩混勻，常溫裂解 5 min 后，使用低溫離心機(jī)12000g離心10min，將上清液轉(zhuǎn)至新的2.0ml離心管中（拍質(zhì)控照片，方便核查），轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，運(yùn)輸時(shí)選擇干冰寄送

3)禁止使用trizol保存組織樣品送樣

4.1.3RNAlater? Tissue Collection保存樣品制備流程（僅RNA適用）

1)用RNAlater? Solution保存組織之前，需要將組織切割成長(zhǎng)寬高均≤ 0.5 mm的小塊

2)如果組織帶血液或其他體液，需要過(guò)夜后更換一次RNAlater? Solution；不要將剛浸入RNAlater Solution中的樣本立即冷凍，需將樣本置于4 °C 保存過(guò)夜（使Solution充分浸潤(rùn)組織樣本），然后轉(zhuǎn)移至-20 °C 或-80 °C 長(zhǎng)期保存

3)RNAlater? Solution 不會(huì)影響組織結(jié)構(gòu)，可以把已保存的組織從 RNAlater? Solution中取出，切下實(shí)驗(yàn)所需的用量，把剩余的組織再放入到原來(lái)的保存液中繼續(xù)保存

4)保存于RNAlater? Solution中樣本，-20 °C 存放時(shí)，樣本不會(huì)結(jié)凍，但可能會(huì)有晶體析出，這并不影響后續(xù)的 RNA 提取工作；-80 °C 存放時(shí)，樣本會(huì)結(jié)凍， 在進(jìn)行 RNA 提取前，需置于冰上融化再進(jìn)行后續(xù)操作，解凍后的樣本可再次放入-80 °C 保存

5)一般來(lái)講，生物樣本保存于RNAlater? Solution中，37 °C可存放1天，25 °C（室溫）可存放1周，4 °C 可存放1個(gè)月，-20 °C 或-80 °C 可長(zhǎng)期保存。但鑒于生物樣本的特殊性及實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性，建議所有保存于RNAlater? Solution中樣本，都要置于-20 °C 或-80 °C 長(zhǎng)期保存

4.2全血

DNA類(lèi)產(chǎn)品推薦使用EDTA抗凝管采集后分裝，RNA類(lèi)產(chǎn)品優(yōu)先推薦使用PAXgene血液RNA管采集。血樣建議為新鮮采集，不建議保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。血液相關(guān)產(chǎn)品僅接收全血或分離的細(xì)胞樣本，不接收血清、血漿

4.2.1DNA常規(guī)產(chǎn)品制備操作流程

1)用醫(yī)用抗凝管或已裝有抗凝劑（選用檸檬酸鈉或 EDTA 抗凝劑，由于會(huì)影響實(shí)驗(yàn)所以不可用肝素）的旋蓋管收集全血樣本

2)上下輕輕顛倒混勻十次后，分裝到常規(guī)EP管中（體積不要超過(guò)EP管的一半），轉(zhuǎn)移至-20或-80 °C長(zhǎng)期保存（實(shí)際根據(jù)采血管的說(shuō)明要求操作）

3)干冰運(yùn)輸

注1：血液采集管請(qǐng)盡量不要用需專(zhuān)門(mén)對(duì)應(yīng)提取試劑盒的采血管，以防送樣后我們因無(wú)對(duì)應(yīng)試劑盒影響提取時(shí)間（盡量送樣前溝通）

注2：采集完血液之后需將血液轉(zhuǎn)移至EP管中，玻璃材質(zhì)采血管冷凍之后易碎

4.2.2Ultra Long ONT樣本制備流程

4.2.2.1新鮮血液

1)采集血液（ 5- 10mL），然后加入含 EDTA 抗凝管中（不可使用肝素 、檸檬酸鈉等抗凝管，建議使用 Cell-Free 采血管，做好標(biāo)記（樣本名稱(chēng)，日期，體積）

2)輕輕顛倒混勻十次，室溫正立放置

3)冰袋（4 °C ）運(yùn)輸需避開(kāi)節(jié)假日（注意冰袋盡可能多放，樣本置于中間，保證箱體溫度維持在 4 °C）。從血液離體算起，運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)人員手中不可超過(guò) 3 天

4.2.2.2凍存血液

1)血液用抗凝管采集后輕輕顛倒混勻十次

2)哺乳動(dòng)物血液分裝到 2ml 離心管里，1ml/管（至少2管，若血量不足，可根據(jù)實(shí)際情況送樣）

3)魚(yú)類(lèi)、禽類(lèi)、兩棲類(lèi)全血分裝到 1.5ml 離心管里， 100ul/管（至少5管,若血量不足，可根據(jù)實(shí)際情況送樣）

4)做好標(biāo)記（樣本名稱(chēng)， 日期，體積），液氮速凍，干冰寄送

4.2.3RNA產(chǎn)品制備操作流程

4.2.3.1PAXgene血液RNA管制備流程（人和靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物優(yōu)先選擇該方式送樣）

1)PAXgene管的介紹

在研究細(xì)胞內(nèi) RNA 使用的許多分子測(cè)試中，采集全血是第一步。 這類(lèi)測(cè)試中的最大挑戰(zhàn)是細(xì)胞內(nèi) RNA不穩(wěn)定，在采血后幾小時(shí)內(nèi)迅速降解。 此外，通過(guò)基因誘導(dǎo)過(guò)程，某些種類(lèi)的 RNA 采血后在體外增加。 體外 RNA 降解和基因誘導(dǎo)均會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄物相對(duì)數(shù)量估計(jì)過(guò)低或過(guò)高。 PAXgene 血液RNA 管含有一種附加劑，通過(guò)減少體外 RNA 降解和盡量減少基因誘導(dǎo)，可穩(wěn)定體內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄譜。 與PAXgene 血液 RNA 套件配套使用時(shí)，PAXgene 血液 RNA 管可以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的基因轉(zhuǎn)錄物檢測(cè)和定量

2)采集前準(zhǔn)備

A.PAXgene Blood RNA Tube（2.5mL采血管，含專(zhuān)用RNA穩(wěn)定劑）

B.符合標(biāo)準(zhǔn)的靜脈采血裝置（無(wú)菌針頭、持針器、止血帶等）

C.毒用品（酒精棉片、碘伏等）

D.生物安全防護(hù)裝備（手套、護(hù)目鏡等）

3)采集流程

A.確保 PAXgene 血液 RNA 管使用前在 18-25?C 溫度下，且正確貼有標(biāo)本識(shí)別標(biāo)簽

B.如果 PAXgene 血液 RNA 管是待抽吸的唯一試管，應(yīng)當(dāng)先抽血至“丟棄管”，再抽血至 PAXgene 血液 RNA 管，這樣便可以灌注放血過(guò)程中使用的采血裝置的內(nèi)部空間。 否則，PAXgene 血液 RNA 管應(yīng)是放血程序中最后抽吸的試管

C.采用您所在機(jī)構(gòu)推薦的標(biāo)準(zhǔn)靜脈穿刺技術(shù)程序，使用采血裝置和試管固定器，采血2.5ml至 PAXgene 血液RNA 管

D.采血后立即輕輕地將PAXgene 血液 RNA 管倒置 8–10 次

E.在室溫下 (18–25?C) 直立存儲(chǔ) PAXgene 血液 RNA 管至少 2 小時(shí)，最多 72 小時(shí)，然后再處理或轉(zhuǎn)移至冷藏室 (2–8?C) 或冷凍室 (-20?C)。 若需要 -70?C / -80?C 的存儲(chǔ)溫度，請(qǐng)參見(jiàn)“PAXgene 血液RNA 管內(nèi)所采集標(biāo)本的冷凍和解凍程序” 以獲取詳細(xì)信息

4)注意事項(xiàng)

A.確保采血管在有效期內(nèi)，無(wú)漏液或變色（正常試劑為淡黃色）

B.不可預(yù)先打開(kāi)管蓋，避免穩(wěn)定劑失效

C.一旦受到碰撞，冷凍的 PAXgene 血液 RNA 管就容易破裂。為降低在運(yùn)輸期間破裂的風(fēng)險(xiǎn)，請(qǐng)按照處理玻璃管的方式來(lái)處理冷凍的試管。使用者必須確認(rèn)自己的 PAXgene 血液 RNA 管冷凍和運(yùn)輸協(xié)議

D.PAXgene 血液 RNA 管填充不足會(huì)導(dǎo)致血液與附加劑的比率錯(cuò)誤，且可能導(dǎo)致分析結(jié)果錯(cuò)誤或產(chǎn)品性能欠佳

E.PAXgene血液 RNA 系統(tǒng)不適用于采集和純化病毒 RNA

4.2.3.2EDTA抗凝管送樣制備流程

1)用醫(yī)用抗凝管或已裝有抗凝劑（選用檸檬酸鈉或 EDTA 抗凝劑，由于會(huì)影響實(shí)驗(yàn)所以不可用肝素）的旋蓋管收集全血樣本

2)上下輕輕顛倒混勻十次后，分裝到常規(guī)EP管中（體積不要超過(guò)EP管的一半），轉(zhuǎn)移至-20或-80 °C長(zhǎng)期保存（實(shí)際根據(jù)采血管的說(shuō)明要求操作）

3)干冰運(yùn)輸

4.3昆蟲(chóng)

1)昆蟲(chóng)樣本，需進(jìn)行表面微生物的清洗，某些吸血性昆蟲(chóng)，例如蚊子，血吸蟲(chóng)，該類(lèi)型樣本可能存在外源污染，需要進(jìn)行切腹，去除腸道處理。較大個(gè)體的選取不帶腸道部分的組織，將組織切成長(zhǎng)寬高均≤0.5 cm 的小塊（即黃豆大?。?，對(duì)于較小個(gè)體只能用整個(gè)個(gè)體的，應(yīng)進(jìn)行適當(dāng)?shù)酿囸I處理（注意保證昆蟲(chóng)的活性）

2)提前準(zhǔn)備好冷凍組織的足量液氮，預(yù)裝樣品的凍存管，并做好標(biāo)記（盡量不使用漢字命名，命名字符控制在5個(gè)以?xún)?nèi)）

3)轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時(shí)選擇干冰運(yùn)輸寄送

注1：小型昆蟲(chóng)組織務(wù)必在信息單中備注微量樣本需液氮交接防止降解。同時(shí)該類(lèi)樣本因只滿(mǎn)足一次或低于常規(guī)一次提取用量，我們無(wú)法保證100%提取合格

注2：蜜蜂送樣時(shí)盡量要求老師取胸部肌肉送樣，整個(gè)蜜蜂送樣提取的核酸狀態(tài)大多數(shù)異常，影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。不建議送實(shí)驗(yàn)室剔除，因?yàn)榻M織速凍過(guò)之后再剔除會(huì)化凍，提取降解的可能性較大

4.4微生物

4.4.1細(xì)菌

1)顯微鏡下觀察細(xì)菌生長(zhǎng)狀態(tài)，建議收集生長(zhǎng)期處于對(duì)數(shù)期的細(xì)菌

2)將適量體積的菌液轉(zhuǎn)移至2 mL 旋蓋尖底離心管（無(wú)菌，無(wú)核酸酶）中，于室溫下14000 ×g 離心1 min

3)棄掉培養(yǎng)基，將細(xì)菌菌體沉淀迅速置于液氮中冷凍1-3 h以上（凍存時(shí)間視組織量而定，保證樣品凍存充分），然后轉(zhuǎn)移至-80 °C長(zhǎng)期保存

4)將樣品管置于管架上固定好后埋在干冰箱的中間部位，大體積干冰運(yùn)輸

5)以下為不規(guī)范送樣圖片：菌體平板（左圖），菌液送樣（右圖）

4.4.2真菌

4.4.2.1單細(xì)胞真菌

單細(xì)胞真菌以酵母菌為代表。一次提取反應(yīng)所需酵母菌的量需≤1×107個(gè)，以 5×106-1× 107個(gè)為宜。您要做的項(xiàng)目要求送樣量較大時(shí)，可以將樣品按上述數(shù)量要求分裝后單獨(dú)保存

1)顯微鏡下觀察酵母菌生長(zhǎng)狀態(tài)，最好收集生長(zhǎng)期處于對(duì)數(shù)期的酵母菌

2)將適量體積的酵母菌液轉(zhuǎn)移至將2 mL旋蓋尖底離心管中（無(wú)菌，無(wú)核酸酶），于室溫下14000×g 離心1 min

3)棄盡培養(yǎng)基，將酵母細(xì)胞沉淀迅速置于液氮中冷凍1-3 h以上（凍存時(shí)間視組織量而定，保證樣品凍存充分），然后轉(zhuǎn)移至-80 °C長(zhǎng)期保存

4)將樣品管置于管架上固定好后埋在干冰箱的中間部位，大體積干冰運(yùn)輸

4.4.2.2多細(xì)胞真菌（大型真菌）

1)取完整菌體，先用大量清水沖洗其表面雜質(zhì)，再用純水清洗一遍，使用吸水紙吸干表面的水份后，用剪刀將組織分割為小塊，做好標(biāo)記（樣本名稱(chēng)，日期,，體 積）放液氮里速凍，干冰寄送

2)菌絲：將無(wú)菌棉簽輕輕觸碰菌落或菌斑的中心部分，避免碰到邊緣或其他細(xì)菌來(lái)源。然后，將棉簽迅速劃過(guò)培養(yǎng)基表面，以收集菌絲轉(zhuǎn)移至將2 mL旋蓋尖底離心管中（無(wú)菌，無(wú)核酸酶），于室溫下14000×g 離心1 min。(可根據(jù)樣品量收集多管或使用15mL螺旋管收集）

4.5水產(chǎn)類(lèi)

水產(chǎn)類(lèi)包括淡水魚(yú)類(lèi)、海水魚(yú)類(lèi)、貝類(lèi)、藻類(lèi)。送樣需要選擇新鮮采集的樣本

1)優(yōu)先選用新鮮采集的樣品送樣，稀有樣本可酌情選取凍存組織。采集樣品時(shí)應(yīng)選取核酸含量較多的部位

2)取得活體組織后，用清水清洗，以去除污物，吸干表面液體

3)活體取材后用預(yù)冷的0.9%生理鹽水進(jìn)行清洗，去除血漬和污物

4)將樣品分割成50 mg左右的小塊（約黃豆大?。瑯悠贩指詈吞幚頃r(shí)應(yīng)盡量在冰上進(jìn)行，防止樣品降解。避免裝樣太滿(mǎn)以至凍裂，造成樣品污染

注：水產(chǎn)類(lèi)樣品需盡量保證為新鮮個(gè)體。盡量避免寄送保存時(shí)間較長(zhǎng)或經(jīng)過(guò)反復(fù)凍融的組織樣品。針對(duì)軟體動(dòng)物可先使用75%的乙醇進(jìn)行漂洗，漂洗干凈后液氮冷凍，干冰運(yùn)輸；針對(duì)刺胞動(dòng)物，可去除頭部和腸道等部位，保留肌肉外壁用于提取

4.6細(xì)胞

4.6.1貼壁細(xì)胞

4.6.1.1液氮速凍法

1)確定細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好；離心得到細(xì)胞沉淀（依據(jù)客戶(hù)實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞離心步驟，注意細(xì)胞離心要適度，不要使細(xì)胞離心過(guò)實(shí)而造成裂解液不能充分滲透，4度離心機(jī)，轉(zhuǎn)速800g為宜）

2)棄去培養(yǎng)基，加入 1 mlLPBS（RNase free，室溫），輕輕將細(xì)胞沉淀懸起， 轉(zhuǎn)移至 2 mL 旋蓋尖底離心管（RNase free）中

3)離心（依據(jù)客戶(hù)實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞離心步驟，注意細(xì)胞離心要適度，不要使細(xì)胞離心過(guò)實(shí)而造成裂解液不能充分滲透，4度離心機(jī)，轉(zhuǎn)速800g為宜）得到細(xì)胞沉淀，棄去PBS，液氮速凍2h之后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時(shí)選擇干冰運(yùn)輸寄送

4.6.1.2TRIzol裂解法

1)離心收集的細(xì)胞迅速溶于 TRIzol 裂解，每 5 X 10^6個(gè)細(xì)胞加 1 mL TRIzol

2)細(xì)胞溶于 TRIzol 后，如出現(xiàn)成團(tuán)，需用吸頭將細(xì)胞團(tuán)吹打散，或者激烈震蕩混勻，使細(xì)胞完全溶于 TRIzol 中充分裂解

3)室溫靜置5min，之后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時(shí)選擇干冰運(yùn)輸寄送

4.6.2懸浮細(xì)胞

4.6.2.1液氮速凍法

1)確定細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好；離心得到細(xì)胞沉淀（依據(jù)客戶(hù)實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞離心步驟，注意細(xì)胞離心要適度，不要使細(xì)胞離心過(guò)實(shí)而造成裂解液不能充分滲透，4度離心機(jī)，轉(zhuǎn)速800g為宜）

2)棄去培養(yǎng)基，加入 1 mlLPBS（RNase free，室溫），輕輕將細(xì)胞沉淀懸起， 轉(zhuǎn)移至 2 mL 旋蓋尖底離心管（RNase free）中

3)離心（依據(jù)客戶(hù)實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞離心步驟，注意細(xì)胞離心要適度，不要使細(xì)胞離心過(guò)實(shí)而造成裂解液不能充分滲透，4度離心機(jī)，轉(zhuǎn)速800g為宜）得到細(xì)胞沉淀，棄去PBS，液氮速凍2h之后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時(shí)選擇干冰運(yùn)輸寄送

4.6.2.2TRIzol裂解法

1)離心收集的細(xì)胞迅速溶于 TRIzol 裂解，每 5 X 10^6個(gè)細(xì)胞加 1 mL TRIzol

2)細(xì)胞溶于 TRIzol 后，如出現(xiàn)成團(tuán)，需用吸頭將細(xì)胞團(tuán)吹打散，或者激烈震蕩混勻，使細(xì)胞完全溶于 TRIzol 中充分裂解

3)室溫靜置5min，之后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時(shí)選擇干冰運(yùn)輸寄送

5、注意事項(xiàng)

核酸提取質(zhì)量與物種及組織部位、采集方法及保存狀態(tài)、提取方法及操作、實(shí)驗(yàn)器材及環(huán)境等因素均有密不可分的聯(lián)系，尤其是三代超長(zhǎng)提取對(duì)樣本的質(zhì)量、總量要求更高，望知悉及理解，并做好樣本備份。為了保障獲得高質(zhì)量的核酸，請(qǐng)務(wù)必按照送樣手冊(cè)所規(guī)定的準(zhǔn)備樣本。對(duì)珍貴樣本或者微量樣本，建議自行提取。

1)組織速凍時(shí)間：組織離體后，胞內(nèi)核酸便開(kāi)始降解，尤其是 RNA，故采集時(shí)，目的組織離體后，需立即速凍，建議 3min 內(nèi)完成，越快越好。速凍時(shí)間過(guò)短會(huì)導(dǎo)致速凍不徹底，核酸有降解風(fēng)險(xiǎn)

2)組織送樣量：建議送樣量適用于 95%的物種組織，少部分組織因胞內(nèi)核酸量較低，需適當(dāng)增加送樣量，比如動(dòng)物皮膚、毛發(fā)等。請(qǐng)嚴(yán)格按照上方組織送樣量要求送樣，送樣量過(guò)少或過(guò)多均不利于提取實(shí)驗(yàn)。采樣量較少會(huì)導(dǎo)致提取的核酸總量、濃度不合格，采樣量過(guò)多反而會(huì)造成速凍不徹底、提取取樣困難、凍融降解等危險(xiǎn)

3)組織狀態(tài)：不建議送組織狀態(tài)差或非生長(zhǎng)旺盛期樣品，核酸有一定幾率降解

4)組織保存管的選擇：所有組織樣品務(wù)必使用離心管或螺紋管保存，切勿直接裝入密封袋（低溫凍脆易破裂，導(dǎo)致樣品泄露，交叉污染）保存

5)組織樣品保存方法選擇：首選液氮速凍；沒(méi)有液氮條件的，可直接放入-80℃冰箱凍存。未使用液氮速凍或液氮速凍時(shí)間過(guò)短都有一定幾率導(dǎo)致核酸降解

6)組織送樣方式的選擇：干冰運(yùn)輸，且需要保證干冰的充足，冰袋和常溫送樣，有幾率導(dǎo)致核酸的降解。除RNA類(lèi)樣品可使用RNAlater保存送樣，其余產(chǎn)品均建議送速凍組織，不建議使用保護(hù)液送樣，化開(kāi)離心會(huì)有幾率導(dǎo)致核酸降解；不建議酒精送樣，固定不徹底，有一定幾率殘留核酸酶，降解核酸

7)凍融組織： 組織凍存后，一旦凍融，核酸降解概率大于 80%，幾乎不可能提取成功，此類(lèi)組織不建議送樣。請(qǐng)各位老師送樣前注意組織保存狀態(tài)， 確保組織未發(fā)生過(guò)凍融情況

8)帶血組織：由于血液沒(méi)有專(zhuān)業(yè)的保護(hù)劑，去除不凈一起速凍送樣會(huì)影響組織的完整性

9)長(zhǎng)年保存的組織：保存時(shí)間超過(guò)一年的組織不建議送樣

10)組織分離要求：正常組織樣本中不能含有病變組織，而病變組織樣本中也不可以?shī)A帶有正常組織，提取實(shí)驗(yàn)時(shí)無(wú)法精確取樣，無(wú)法稱(chēng)重。組織量過(guò)多的不能全部取樣，只隨機(jī)選取適量組織提取

11)對(duì)于同一個(gè)組織樣品需要同時(shí)提取 DNA和 RNA 的，請(qǐng)務(wù)必分成兩管分批次送樣。樣本的特殊處理包括：鹽處理、溫度處理、藥物處理、病毒侵染、傷害處理、干旱處理等脅迫處理方式，不同程度的處理對(duì)樣本的核酸質(zhì)量會(huì)造成不同程度的影響，常見(jiàn)的會(huì)導(dǎo)致核酸 的降解或者得率降低。因此，經(jīng)過(guò)特殊處理的樣本，在送樣時(shí)，務(wù)必請(qǐng)?jiān)跇颖拘畔沃羞M(jìn)行詳細(xì)的備注，以便盡量提高提取的成功率和避免樣本的浪費(fèi)

6、不合格樣品存在風(fēng)險(xiǎn)

6.1樣本總量不足、濃度過(guò)低存在風(fēng)險(xiǎn)

1)文庫(kù)構(gòu)建失敗

2)文庫(kù)產(chǎn)量低不能上機(jī)測(cè)序或測(cè)序數(shù)據(jù)量不足

3)導(dǎo)致數(shù)據(jù)隨機(jī)性異常

4)數(shù)據(jù)質(zhì)量差

6.2降解樣本風(fēng)險(xiǎn)

1)文庫(kù)構(gòu)建失敗

2)文庫(kù)產(chǎn)量低不能上機(jī)測(cè)序或測(cè)序數(shù)據(jù)量不足

3)導(dǎo)致數(shù)據(jù)隨機(jī)性異常

4)數(shù)據(jù)質(zhì)量差

5)導(dǎo)致數(shù)據(jù)duplication比例高、隨機(jī)性差

6)導(dǎo)致Small RNA rRNA比例高，影響有效數(shù)據(jù)，文庫(kù)片段異常

6.3蛋白或其他雜質(zhì)污染

1)可能影響Small RNA電泳分離，造成切膠不準(zhǔn)，影響問(wèn)題質(zhì)量

2)可能影響RNA-seq磁珠分離導(dǎo)致建庫(kù)失敗，或即使達(dá)到上機(jī)要求也可能導(dǎo)致文庫(kù)隨機(jī)性差等問(wèn)題

3)文庫(kù)構(gòu)建失敗

4)文庫(kù)產(chǎn)量低不能上機(jī)測(cè)序或測(cè)序數(shù)據(jù)量不足

6.4目標(biāo)RNA含量低

1)總RNA達(dá)到要求，但由于樣本特異性，small RNA含量低于正常樣本，導(dǎo)致建庫(kù)失敗

2)總RNA達(dá)到要求，但由于處理或組織部位的特異性，mRNA降解或含量低，導(dǎo)致建庫(kù)失敗或者測(cè)序數(shù)據(jù)中rRNA 數(shù)據(jù)比例高