small RNA實(shí)驗(yàn)流程材料方法

 

1、提取方法

1)植物多組學(xué)產(chǎn)品組織細(xì)胞：Small RNA提取試劑盒，判定時(shí)結(jié)合其他產(chǎn)品的總RNA核酸判定

2)植物SRNA產(chǎn)品，艾德萊RN40（廠家：艾德萊，型號：RN40））試劑盒

3)動物（非昆蟲）：TRIzol

2、檢測方法

2.1檢測方法

使用 Nanodrop2000 （廠家：賽默飛,型號： Nanodrop2000）對于提取的核酸進(jìn)行濃度純度檢測，并使用LabChip GX（廠家：鉑金埃爾默，型號：LabChip GX Touch HT）對完整性進(jìn)行檢測

2.2判定標(biāo)準(zhǔn)

2.2.1Small RNA提取試劑盒判定標(biāo)準(zhǔn)

1)總量≥0.4（ug），滿足 2 次建庫

2)濃度≥20（ng/ul）

3)體積≥10(ul)

4)OD260/280 在 1.7-2.5 之間，OD260/230 在 0.5-2.5 之間，260nm 吸收峰顯示正常

5)需結(jié)合峰圖判斷，是否有5s峰，以及其他產(chǎn)品是否有降解

6)樣本狀態(tài)正常，樣本粘稠、顏色異常、有渾濁或不溶物均不合格

2.2.2艾德萊RN40、TRIzol

7)總量≥1（ug），滿足 2 次建庫

8)濃度≥80（ng/ul）

9)體積≥10(ul)

10)OD260/280 在 1.7-2.5 之間，OD260/230 在 0.5-2.5 之間，260nm 吸收峰顯示正常

11)RIN 值≥6.0（非植物），RIN 值≥6.0（植物）需結(jié)合基線判斷，28S/18S≥1 且基線無上抬或輕微上抬

12)樣本狀態(tài)正常，樣本粘稠、顏色異常、有渾濁或不溶物均不合格

3、樣本狀態(tài)

樣本狀態(tài)正常，樣本粘稠、顏色異常、有渾濁或不溶物均不合格建庫方法

3.1連接3’接頭

向準(zhǔn)備好的RNA中加入3′ Adapter，混勻瞬離后PCR儀70℃加熱2min預(yù)變性，然后加入RL3 Buffer及RL3 Enzyme Mix，混勻離心后，金屬浴孵育進(jìn)行連接接頭反應(yīng)

3.2反轉(zhuǎn)錄引物退火

向上步反應(yīng)的離心管中加入RT Primer，混勻離心后，放入PCR儀中設(shè)定好的程序進(jìn)行退火反應(yīng)

3.3連接5’接頭

向上步反應(yīng)的離心管中加入RL5 Adapter（70℃加熱2min進(jìn)行變性后使用）、RL5 Buffer及RL5 Enzyme Mix，混勻離心后，金屬浴孵育進(jìn)行連接接頭反應(yīng)

3.4反轉(zhuǎn)錄

向上步反應(yīng)的離心管中加入RT buffer、RT Enzyme mix，混勻離心后，放入PCR儀中設(shè)定好的程序進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

3.5PCR 擴(kuò)增

向上述反應(yīng)產(chǎn)物中依次加入Amplification Mix、Universal Primer（10μM）和IndexX Primer*（10μM），混勻離心后，放入PCR儀中設(shè)定好的程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。

注意：IndexX Primer*中包含Index序列，使用時(shí)需嚴(yán)格按照上機(jī)調(diào)度安排的序列添加

3.6PCR 產(chǎn)物純化

1)瞬時(shí)離心 PCR 反應(yīng)管，加入相應(yīng)體積的磁珠，充分混勻

2)室溫孵育，然后置于磁力架上靜置，小心移除上清液

3)向反應(yīng)管中加入新鮮配制的 80% ethanol ，磁力架上靜置 30s ，移棄上清液，重復(fù)該步驟 1 次

4)打開管蓋，磁珠干燥后加入 Nuclease-free Water 洗脫 DNA ，吹吸混勻，室溫靜置，磁力架上靜置，小心 吸取上清至新的離心管中，并分裝 1.5 μL 于新的 1.5 mL 離心管中用于片段檢測，-20℃保存

3.7PAGE凝膠電泳和切膠

1)向PCR純化產(chǎn)物中加入10μL 6×Gel Loading dye，輕彈混勻，避免出現(xiàn)氣泡

2)取一板6% TBE Gel（1.0mm×10well）膠板放入電泳槽中，倒入TBE緩沖液后，點(diǎn)入marker和樣品

3)蓋上電泳槽蓋，在指定電壓下開始電泳，電泳結(jié)束后，取出膠放入EB染色液中進(jìn)行染色

4)染色結(jié)束后，在紫外燈下照相保存

5)紫外燈下用刀片切取指定范圍的條帶，并放入離心管中進(jìn)行保存

3.8膠回收

1)將膠塊在離心機(jī)的高速離心力作用下進(jìn)行破碎，加入1×Elution buffer進(jìn)行溶膠

2)將溶膠液轉(zhuǎn)入到Spin-X過濾柱中，離心力作用下回收溶膠液

3)向上述溶膠液中加入Linear Acrylamide、3M NaAc及100% Ice cold ethanol，低溫沉淀30min

4)將上述沉淀液在離心機(jī)下離心，然后用80%乙醇洗滌沉淀

5)用TE buffer溶解沉淀，即為SRNA文庫

3.9文庫質(zhì)檢

文庫通過 Qsep-400 方法進(jìn)行質(zhì)檢，滿足如下指標(biāo)即可上機(jī)檢測

3.10建庫試劑耗材

1)文庫構(gòu)建試劑盒：VAHTS Small RNA Library Prep Kit for iiiumina v2，貨號NR811-02

2)產(chǎn)物純化磁珠：VAHTSTM DNA Clean Beads，貨號N411-03

3)質(zhì)檢使用試劑：Qsep400 標(biāo)準(zhǔn)DNA 卡夾

4)定量使用試劑： Qubit TM dsDNA HS Assay Ki

5)1.5ml離心管、0.2ml PCR管、10ul，200ul槍頭：Axygen

3.11建庫設(shè)備

4、測序方法

測序設(shè)備：NovaSeq X plus

測序試劑盒：NovaSeqTM X? Series25B Rgt Kit