SLAF實(shí)驗(yàn)流程材料方法

 

1、提取方法

1)樣本研磨

2)將裝有樣品的離心管加入1 ml 65 ℃預(yù)熱的CTAB提取液和2%的巰基乙醇（如 果是動物組織的話加50ul濃度為20mg/ml的蛋白酶K），在渦旋振蕩儀上震蕩混勻，使樣品完全懸浮，65 ℃烘箱溫浴40 -60min，不能超過1h

3)溫浴期間搖勻2-3次，保證裂解充分。取出后，冷卻至室溫

4)12000 rpm離心5 min，取上清液900ul至新的2.0 ml 無菌離心管中（。加入等體積三氯甲烷/異戊醇（24:1），上下顛倒混勻， 12000 rpm離心20 min

5)吸取上清液700 ul至新的2.0 ml 無菌離心管，加入等體積三氯甲烷-異戊醇 （24:1），上下顛倒混勻， 12000 rpm離心20 min

6)吸取上清液450 ul至新的1.5 ml無菌離心管中，加入上清液體積的2/3體積（300ul）的異丙醇和1/10體積（45ul）的3M乙酸鈉，充分混勻，-20 ℃放置1 h

7)12000rpm離心10min（如果從-20℃取出后絮狀沉淀較多，可12000rpm離心20s），棄上清，瞬時離心，用200ul槍頭吸棄多余液體

8)向沉淀中加1ml 75%的乙醇溶液，輕彈至沉淀懸浮，12000rpm離心5min，棄上清

9)瞬時離心，用黃槍頭吸棄多余液體，離心管開蓋室溫晾干3-5min至DNA沉淀呈半透明狀

10)加入≥20 ul含10 ng/ul RnaseA的超純水，根據(jù)沉淀大小決定融水體積，溶解DNA沉淀，37 ℃水浴鍋消化1 h后保存在-20 ℃冰箱備用

注：常規(guī)植物組織提取正常使用CTAB提取，疑難植物（薔薇科等多糖類植物）組織裂解前使用干擾（清洗掉部分多糖等雜質(zhì)）先清洗，清洗完之后在加裂解液；動物組織在裂解時加入2%的蛋白酶K；宏基因組項(xiàng)目提取在裂解時加入5%-10%的溶菌酶

2、檢測方法

2.1檢測方法

使用 使用 Qubit（廠家YEASEN, 型號CAT 12642-A ，試劑1XdsDNA HS Assay kit for Qubit ）檢測核酸濃度，使用1%的瓊脂糖電泳檢測完整性

2.2判定標(biāo)準(zhǔn)

濃度≥5ng/ul

總量大于等于8 0 ng

主帶清晰、主帶不清晰，主要彌散在2K以上

核酸狀態(tài)正常

3、建庫方法

3.1建庫流程圖

3.2樣本稀釋

1)核對任務(wù)單中項(xiàng)目樣品基本信息，根據(jù)信息單一一對應(yīng)排好樣本

2)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)用量，計算“稀釋后濃度(ng/μL)”和“吸取體積(μL)”

3)取已滅菌的國產(chǎn)96孔PCR板，在板子上標(biāo)注相應(yīng)的項(xiàng)目編號、板號、日期及稀釋字樣，并開始稀釋

4)稀釋后，震蕩輕混（勿劇烈震蕩）并瞬時離心，對稀釋后的樣品取2 μL做Nanodrop 檢測

5)如果濃度與理論濃度偏差較大先檢查樣品是否用錯，在確認(rèn)樣品使用無誤的情況下，濃度高的加水稀釋，濃度低的加DNA或者重新稀釋

3.3步驟A

根據(jù)任務(wù)單的酶切方案選擇下面所列單酶切或雙酶切方案，取適當(dāng)起始量樣本，進(jìn)行37℃酶切反應(yīng)，在水浴鍋中反應(yīng)時長不超過15h

3.4步驟B

在上述反應(yīng)產(chǎn)物中加入試劑，在PCR儀器中進(jìn)行3′端加A處理

3.5步驟C

向上述產(chǎn)物中加入一定體積的連接試劑及index，充分混勻，進(jìn)行Dual-index測序接頭反應(yīng)

3.6PCR 擴(kuò)增及電泳檢測

1)加入 PCR 反應(yīng)所需的各種試劑，混勻，離心

2)根據(jù) PCR 反應(yīng)條件，放入 PCR 儀中進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增

3)對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測

3.7PCR 產(chǎn)物的純化及電泳檢測

1)將全部PCR產(chǎn)物進(jìn)行磁珠純化

A.將MagicPure Size Selection DNA Beads（全式金）磁珠提前 30min 室溫平衡備用

B.將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)入 1.5mL 離心管中，加入（0.8 X）體積已混勻的磁珠，吹吸混勻

C.旋轉(zhuǎn)混勻儀上，室溫混勻，瞬時離心，而后置于磁力架上，靜置，移棄上清液

D.離心管置于磁力架上，向離心管中加入新鮮配制的 80%乙醇，磁力架上靜置 30s，移棄上清液

E.重復(fù)步驟（4）一次，第二次清洗后，瞬時離心，用 10μL 槍頭將上清液去除干凈

F.離心管置于磁力架上，打開管蓋，室溫干燥至磁珠表面無光澤，有細(xì)微裂紋

G.取下離心管，加入無菌水，吹吸混勻，室溫靜置，而后磁力架上靜置，吸取上清液轉(zhuǎn)入新的 0.2mL PCR 管中

2)對PCR純化產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測

3.8定量及混樣

1)將PCR純化產(chǎn)物進(jìn)行Nanodrop 定量

2)根據(jù)上機(jī)數(shù)據(jù)量及定量結(jié)果，電泳結(jié)果，回收膠電泳上樣量，進(jìn)行混樣量計算

3)向1.5ml離心管中按照計算好的混樣量，加入PCR純化產(chǎn)物，并混合均勻

3.9電泳切膠

1)配制2%電泳回收膠

2)使用TAE跑電泳，根據(jù)下單規(guī)定的切膠范圍進(jìn)行切膠

3)對切膠片段進(jìn)行過柱純化回收

3.10上機(jī)文庫構(gòu)建PCR擴(kuò)增

1)在上述膠回收產(chǎn)物中加入 PCR 反應(yīng)所需的各種試劑，混勻，離心

2)根據(jù) PCR 反應(yīng)條件，放入 PCR 儀中進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增及純化

3.11上機(jī)文庫準(zhǔn)備

將PCR純化產(chǎn)物出庫，進(jìn)行后續(xù)文庫質(zhì)檢及上機(jī)測序

3.12文庫質(zhì)檢

1)質(zhì)檢方法：文庫通過 Qsep-400進(jìn)行片段質(zhì)檢， 使用 Qubit 3 .0進(jìn)行文庫濃度的定量

2)質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)：濃度≥1ng/ul ，峰圖在要求切膠范圍之內(nèi)，片段單一無雜峰

3.13建庫試劑耗材

1)文庫構(gòu)建試劑：NEB（New England Biolabs）（使用的是單個散裝試劑，不是成套試劑盒，具體試劑保密）

2)產(chǎn)物純化磁珠：VAHTSTM DNA Clean Beads， 貨號N411-03

3)質(zhì)檢使用試劑：Qsep400 標(biāo)準(zhǔn)DNA 卡夾

4)定量使用試劑：Qubit TM dsDNA HS Assay Ki

5)1.5ml離心管、0.2ml PCR管、10ul，200ul槍頭：Axygen

3.14建庫設(shè)備

4、測序方法

測序設(shè)備：NovaSeq X plus

測序試劑盒：NovaSeqTMX? Series25B Rgt Kit