Reseq-illumina實驗全過程流程材料方法

1、提取方法

1)樣本研磨

2)將裝有樣品的離心管加入1 ml 65 ℃預熱的CTAB提取液和2%的巰基乙醇（如 果是動物組織的話加50ul濃度為20mg/ml的蛋白酶K），在渦旋振蕩儀上震蕩混勻，使樣品完全懸浮，65 ℃烘箱溫浴40 -60min，不能超過1h

3)溫浴期間搖勻2-3次，保證裂解充分。取出后，冷卻至室溫

4)12000 rpm離心5 min，取上清液900ul至新的2.0 ml 無菌離心管中（。加入等體積三氯甲烷/異戊醇（24:1），上下顛倒混勻， 12000 rpm離心20 min

5)吸取上清液700 ul至新的2.0 ml 無菌離心管，加入等體積三氯甲烷-異戊醇 （24:1），上下顛倒混勻， 12000 rpm離心20 min

6)吸取上清液450 ul至新的1.5 ml無菌離心管中，加入上清液體積的2/3體積（300ul）的異丙醇和1/10體積（45ul）的3M乙酸鈉，充分混勻，-20 ℃放置1 h

7)12000rpm離心10min（如果從-20℃取出后絮狀沉淀較多，可12000rpm離心20s），棄上清，瞬時離心，用200ul槍頭吸棄多余液體

8)向沉淀中加1ml 75%的乙醇溶液，輕彈至沉淀懸浮，12000rpm離心5min，棄上清

9)瞬時離心，用黃槍頭吸棄多余液體，離心管開蓋室溫晾干3-5min至DNA沉淀呈半透明狀

10)加入≥20 ul含10 ng/ul RnaseA的超純水，根據(jù)沉淀大小決定融水體積，溶解DNA沉淀，37 ℃水浴鍋消化1 h后保存在-20 ℃冰箱備用

注：常規(guī)植物組織提取正常使用CTAB提取，疑難植物（薔薇科等多糖類植物）組織裂解前使用干擾（清洗掉部分多糖等雜質(zhì)）先清洗，清洗完之后在加裂解液；動物組織在裂解時加入2%的蛋白酶K；宏基因組項目提取在裂解時加入5%-10%的溶菌酶

2、檢測方法

2.1檢測方法

使用 Qubit（廠家YEASEN, 型號CAT 12642-A ，試劑1XdsDNA HS Assay kit for Qubit ）檢測核酸濃度，使用1%的瓊脂糖電泳檢測完整性

2.2判定標準

濃度≥1ng/ul

總量大于等于 30ng

完整性主帶清晰、主帶不清晰，主要彌散在2K以上，跳帶、或嚴重鋸齒狀、或“H”形或下方有非常嚴重的非RNA樣彌散等核酸狀態(tài)正常

3、建庫方法

3.1基因組打斷加樣（酶切打斷）及末端修復

1)樣品稀釋分裝

A.取基因組DNA 10ng（qubit定量）進行建庫

B.向以上 DNA中加入以下試劑立即置于PCR儀中進行反應

2)酶切打斷（75℃熱蓋）

3.2接頭連接

1)試劑體系

2）操作流程

A.向打斷末修加A產(chǎn)物加入以上試劑和 DNA Adapter
B.按照下述程序PCR儀上反應

3)連接產(chǎn)物純化

用Vazyme DNA Clean磁珠對上述步驟中的PCR產(chǎn)物做0.8×磁珠純化

4)片篩純化

A.向上述產(chǎn)物中加入（0.485×）磁珠，混勻后室溫孵育5 min；而后置于磁力架上，吸取全部上清液至新的96孔板中

B.加入（0.1×）磁珠，混勻后室溫孵育5 min；而后置于磁力架上，移棄上清液

C.80%乙醇清洗磁珠兩次后移棄上清液

D.加入10 μL nuclease-free water，混勻后室溫靜置5 min；而后磁力架上，吸取8 μL上清液進行下一步PCR擴增

3.3PCR 擴增

1)PCR體系

2)PCR程序

3.4PCR 產(chǎn)物純化

用Vazyme DNA Clean磁珠對上述步驟中的PCR產(chǎn)物做0.6×磁珠純化，得到合格文庫

3.5文庫質(zhì)檢

1)質(zhì)檢方法：文庫通過 Qsep-400 進行片段質(zhì)檢， 使用 Qubit 3 .0 進行文庫濃度的定量

2)質(zhì)檢標準：濃度≥1ng/ul， 質(zhì)檢片段中心值430-530bp， 平均值420-580bp 之間， 峰型呈正態(tài)分布， 片段單一無雜峰

3.6引物接頭序列

adpter3=”AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC”;

adpter5=”AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT”;

3.7建庫試劑耗材

1)文庫構建試劑盒：VAHTSTM Fg DNA Library Prep Kit? for I11umina 貨號ND617-02

2)產(chǎn)物純化磁珠：VAHTSTM DNA Clean Beads， 貨號N411-03

3)質(zhì)檢使用試劑：Qsep400 標準DNA 卡夾

4)定量使用試劑：Qubit TM dsDNA HS Assay Ki

5)1.5ml離心管、0.2ml PCR管、10ul，200ul槍頭：Axygen

3.8建庫設備

4、測序方法

測序設備：NovaSeq X plus

測序試劑盒：NovaSeqTMX? Series25B Rgt Kit