ATAC 實(shí)驗(yàn)流程材料方法

 

1、提取方法

采用梯度離心的方式提取細(xì)胞核，使用Qiagen PCR（28006）純化試劑盒純化DNA

1)裂解液配方

A.裂解液1（適用于胚胎等較難裂解的細(xì)胞）

10 mM Tris-HCl (pH 7.4)， 10 mM NaCl， 3 mM MgCl2，0.5% NP-40

Wu J, Xu J, Liu B, et al. Chromatin analysis in human early development reveals epigenetic transition during ZGA[J]. Nature, 2018

B.裂解液2

10 mM Tris·Cl，（pH 7.4），10 mM NaCl，3 mM MgCl2，0.1% (v/v) Igepal CA-630

Buenrostro J, Wu B, Chang H, et al. ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide[M]// Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Inc. 2015:21.29.1

C.裂解液3（適用于植物細(xì)胞，注意細(xì)胞壁的處理）

15mM Tris-HCl pH7.5， 20 mM NaCl， 80 mM KCl， 0.5 mM spermine， 5 mM 2-ME， 0.2% TritonX-100

Lu Z, Hofmeister BT, Vollmers C, et al. Combining ATAC-seq with nuclei sorting for discovery of cis-regulatory regions in plant genomes[J]. Nucleic Acids Research, 2016, 45(6)

注：不同的細(xì)胞適用的去污劑的類型和濃度有所差異，需要根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)細(xì)胞做對(duì)應(yīng)的調(diào)整，較強(qiáng)的裂解液會(huì)影響調(diào)控區(qū)域的打開與關(guān)閉，裂解強(qiáng)度不夠則影響細(xì)胞破裂，影響酶進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi)

2)細(xì)胞收集

A.500×g 離心 5 min 收集細(xì)胞，棄上清，PBS 將細(xì)胞沉淀重懸

B.細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)

C.取含目標(biāo)細(xì)胞數(shù)目的單細(xì)胞懸液，500×g 離心 5 min 收集細(xì)胞，棄上清棄盡上清，用 50 μl 預(yù)冷的 Lysis buffer 重懸細(xì)胞，冰上放置 10 min 裂解細(xì)胞。

D.注：若樣本體積在 5ul 以內(nèi)，可直接加入裂解液裂解細(xì)胞

E.在 4℃下，500×g 離心 5 min 收集細(xì)胞核

F.棄上清，在下一步實(shí)驗(yàn)開始前置于冰上

注：為了防止樣本丟失，可在離心時(shí)，在細(xì)胞聚集的管壁方向做好標(biāo)記，吸取上清時(shí)，在沉淀對(duì)立面輕輕吸取液體

2、檢測(cè)方法

2.1檢測(cè)方法

取新的1.5ml離心管，加入10ul臺(tái)盼藍(lán)和10ul樣品，槍頭吹吸混勻，吸取10ul于細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，置于細(xì)胞計(jì)數(shù)儀上進(jìn)行計(jì)數(shù)，記錄細(xì)胞濃度和細(xì)胞活性

2.2判定標(biāo)準(zhǔn)

細(xì)胞數(shù)大于50000個(gè)

3、建庫(kù)方法

3.1DNA的純化及打斷

1)配置打斷mix，配制完成后，用200ul槍頭吹吸混勻

2)37℃、700rpm金屬浴30min

3.2DNA的純化

1)打斷結(jié)束后，直接在原管中加入250ul Buffer PB和10ul 3M醋酸鈉（PH 5），槍頭吹吸混勻

2)將上述溶液全部轉(zhuǎn)移至4℃柱子（4℃保存），室溫、13000rpm離心1min

3)棄掉收集液，將柱子放回原管，加入750ul Buffer PE，室溫、13000rpm離心1min

4)棄掉收集液，將柱子放回原管，室溫、13000rpm離心1min

5)棄掉收集管，將柱子轉(zhuǎn)移到剪掉蓋子的1.5ml離心管，打開柱子的蓋子，環(huán)吸去除柱子底部的剩余PE Buffe

6)加入27ul EB溶液至柱子的中心（即白色濾膜），室溫靜置1min

7)室溫13000rpm離心1min，離心管底部溶液即為提取的DNA

3.3PCR 擴(kuò)增

配制PCR MIX，所用試劑盒為Vazyme TD202（-20℃保存），將提取的DNA轉(zhuǎn)移至0.2ml PCR管，根據(jù)下表配制PCR MIX，配制完成后，用200ul槍頭吹吸混勻上述MIX
1)PCR體系

2)PCR程序

注：PCR產(chǎn)物Qubit定量濃度低于10ng/ul，需加擴(kuò)2個(gè)cycle，加擴(kuò)時(shí)，去掉上述PCR程序的第一步

3.4片段篩選及文庫(kù)純化

1)將擴(kuò)增后的PCR體系轉(zhuǎn)移至新的的1.5ml離心管，加入27.5ul XP磁珠，槍頭吹吸混勻，室溫孵育5min

2)將離心管置于磁力架上，靜置5min至液體澄清

3)小心將上清轉(zhuǎn)移到新的1.5ml離心管中

4)向上述離心管中加入50ul XP磁珠，槍頭吹吸混勻，室溫孵育5min

5)將離心管置于磁力架上，靜置5min至液體澄清，棄上清，向離心管中加入200ul 80%乙醇，室溫孵育15s，棄上清，重復(fù)該步驟一次

6)取下離心管，瞬時(shí)離心3s，再次置于磁力架上，用10ul槍頭除盡底部殘留乙醇

7)打開離心管蓋子，晾干磁珠至磁珠表面不反光呈霧面狀態(tài)即可

8)取下離心管，加入21ul EB，槍頭吹吸混勻，室溫孵育5min

9)將離心管置于磁力架上，待液體澄清后，取出2ul上清液于新的1.5ml離心管進(jìn)行2100檢測(cè)，取出1ul進(jìn)行Qubit定量

10)吸取所有剩余上清液于新的1.5ml離心管中（離心管蓋上標(biāo)明文庫(kù)名稱、出庫(kù)日期、INDEX）

3.5文庫(kù)質(zhì)檢

1)質(zhì)檢方法：文庫(kù)通過 Qsep-400 進(jìn)行片段質(zhì)檢， 使用 Qubit 3 .0 進(jìn)行文庫(kù)濃度的定量

2)質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)：庫(kù)檢片段呈Ladder狀，第一個(gè)主峰在200bp左右，片段無前后拖尾，無接頭

3.6引物接頭序列

使用TruePrep Index Kit V2 for Illumina構(gòu)建的DNA文庫(kù)結(jié)構(gòu)如下：

試劑盒中提供包含8種N5XX以及12種N7XX，可組合成96種不同的雙端Index組合，用于高通量測(cè)序時(shí)區(qū)分不同樣品。

Index的序列如下表所示

IIIIIIII表示8 bp index序列，測(cè)序前根據(jù)測(cè)序平臺(tái)在Sample Sheet中輸入所使用的Index對(duì)應(yīng)序列

3.7建庫(kù)試劑耗材

1)文庫(kù)構(gòu)建試劑盒：TruePrep? DNA Library Prep Kit V2 for Illumina，貨號(hào)TD501-TD503

2)接頭試劑盒：TruePrep? Index Kit V2 for Illumina，貨號(hào)TD202

3)產(chǎn)物純化磁珠：VAHTSTM DNA Clean Beads， 貨號(hào)N411-03

4)質(zhì)檢使用試劑：Qsep400 標(biāo)準(zhǔn)DNA 卡夾

5)定量使用試劑：Qubit TM dsDNA HS Assay Ki

6)1.5ml離心管、0.2ml PCR管、10ul，200ul槍頭：Axygen

3.8建庫(kù)設(shè)備

4、測(cè)序方法

測(cè)序設(shè)備：NovaSeq X plus

測(cè)序試劑盒：NovaSeqTMX? Series25B Rgt Kit