iMeta | T2T水平的百合杜鵑基因組被報道

2025年3月5日，貴州大學(xué)王孝敬、牛素貞和華北理工大學(xué)宋小明等在iMeta在線發(fā)表了題為“T2T genome, pan-genome analysis, and heat stress response genes in Rhododendron?species”的文章。該研究首次報道了T2T水平的百合杜鵑基因組，鑒定了幾個與熱脅迫相關(guān)的關(guān)鍵基因和miRNA，為杜鵑屬植物的比較基因組學(xué)和功能基因組學(xué)研究提供了豐富的資源。

文章題目：T2T?genome,?pan-genome?analysis?and?heat?stress response?genes?in?Rhododendron?species

發(fā)表期刊：iMeta

影響因子：23.8

合作單位：貴州大學(xué)，華北理工大學(xué)

百邁客生物為此項研究提供基因組測序及部分分析服務(wù)。

研究亮點：

① 該研究首次報道了具有13條染色體的高質(zhì)量端粒到端粒（T2T）的百合杜鵑基因組；

② 基于15個杜鵑屬植物基因組，對杜鵑屬植物進行了泛基因組分析；

③ 結(jié)合基因組測序和全轉(zhuǎn)錄組測序，鑒定了幾個與熱脅迫相關(guān)的關(guān)鍵基因和miRNA，為杜鵑屬植物的比較基因組學(xué)和功能基因組學(xué)研究提供了豐富的資源。

研究背景

杜鵑花屬于杜鵑花科，是木本植物中最大的屬之一。全世界大約有1000種杜鵑花，中國是重要的分布中心。它們在喜馬拉雅-橫斷山脈經(jīng)歷了進化輻射，橫斷山脈是世界生物多樣性的熱點。杜鵑花屬植物因其觀賞價值而在園藝中占有重要地位。全球氣候變化導(dǎo)致溫度升高，而熱脅迫會影響植物的生長發(fā)育。然而，杜鵑花植物通常適應(yīng)較冷的氣候。利用多組學(xué)分析和分子生物學(xué)技術(shù)研究杜鵑花對高溫脅迫的響應(yīng)機制，對選育耐熱品種、擴大杜鵑花栽培范圍具有重要意義。

材料及方法

T2T基因組組裝：Rhododendron liliiflorum

泛基因組分析：4個本次組裝的基因組+11個已報到的杜鵑屬基因組

全轉(zhuǎn)錄組：CK熱處理、熱處理3天（H3）和6天（H6）條件下進行了全轉(zhuǎn)錄組測序

兩對具有代表性的miRNAs和相關(guān)靶基因進行功能驗證。

研究結(jié)果

1.杜鵑屬植物基因組測序、組裝與評價

該研究通過PacBio HiFi、Oxford Nanopore Technology（ONT）、Illumina和Hi-C技術(shù)（圖1A，表S1-6）對四種杜鵑花植物（Rhododendron liliiflorum、Rhododendron decorum、Rhododendron platypodum和Rhododendron concinnum）進行從頭基因組測序。通過K-mer估算的R. liliiflorum、R. decorum、R. platypodum和R. concinnum的基因組大小分別為759.08 Mb、581.05 Mb、593.47 Mb和1356.22 Mb，并通過流式細胞術(shù)進一步驗證（表S1，圖1B）。

作者發(fā)現(xiàn)，R. concinnum的基因組幾乎是其他三個物種的兩倍大。因此，作者們利用流式細胞術(shù)進一步分析了染色體核型，首次發(fā)現(xiàn)R. concinnum為四倍體，核型為2n=4x=52，與其他三個二倍體物種（2n=2x=26）有明顯差異（圖1C，表S1）。

4個物種的基因組大小分別為793.25 Mb、649.87 Mb、652.27 Mb和1321.11 Mb（表S1）。經(jīng)Hi-C檢測，4個種的染色體錨定率均在97.90%以上（圖1D，表S5）。作者獲得了4個高質(zhì)量的組裝基因組，支架N50大于48.68 Mb。核心真核基因作圖法（CEGMA）值從95.63%到99.56%，基準通用單拷貝同源序列（BUSCO）值從96.65%到97.34%，讀取作圖率超過99.40%（表S7）。

最重要的是，作者獲得了一個高質(zhì)量的R. liliiflorumT2T基因組，該基因組由13條染色體組成，檢測到24個端粒和13個著絲粒（圖S1A，表S8-11）。其中11條染色體在端粒與端粒之間沒有間隙，另外2條染色體只有一個間隙。百合杜鵑花基因組的重疊群N50大于58.56MB，大于以往大多數(shù)杜鵑基因組的重疊群N50。采用BUSCO軟件對基因組完整性進行評估（96.65%），基因組一致性質(zhì)量值（QV）為43.71（表S1）。基因組LTR組裝指數(shù)（LAI）值為21.15（圖S1B），表明已達到最高質(zhì)量水平（LAI≥20）。

重復(fù)序列占4個基因組的49.10%以上，以長末端重復(fù)序列（LTRs）最多（圖1E，表S11）。在這四個基因組中，共預(yù)測到41406、41084、40556和83203個基因（表S12）。檢測到超過97.15%的BUSCO基因，說明預(yù)測的完整性較高（表S13）。NR、eggNOG、GO、KEGG、TrEMBL、KOG、Swissprot和Pfam數(shù)據(jù)庫對92.16%以上的基因進行了注釋（表S14）。共檢測到2355、4862、2852和9511個非編碼RNA（表S15）。

2.15個杜鵑屬植物泛基因組分析

杜鵑屬植物以其多樣的花朵展示而聞名，近年來，隨著第一個R. delavayi基因組的公布，一些基因組被解碼，引起了科學(xué)界的高度關(guān)注。報道了幾種杜鵑屬植物的基因組，如R. griersonianum、R. Henanense、R. Irroratum、R. kiyosumense、R. Ripense、R. Vialii、R. nivale和R. williamsianum。這些基因組為泛基因組研究奠定了基礎(chǔ)?；谶@四個高質(zhì)量基因組以及11個先前發(fā)表的基因組，對杜鵑屬植物進行了泛基因組分析（圖1F，表S16）。選擇T2T水平的R. liliiflorum基因組作為參考。該泛基因組通過添加394.57?Mb和14424個基因，擴展了T2T水平的R. liliiflorum基因組。15個物種的基因家族數(shù)量為45731個，包括5734個核心基因家族、37027個可有可無的基因家族和2970個私有基因家族（圖1G、圖S2A、表S17）。利用打亂圖分析了15個物種間基因家族共享與唯一性的關(guān)系。最后，作者基于聚類分析構(gòu)建了基因家族存在與否的分布圖（圖1H）。在2970個私有基因家族中，R.irroratum（1705）的物種特異性基因最多（表S17，圖S2B）。功能富集分析表明，“倍半萜和三萜生物合成”和“亞油酸代謝”途徑顯著富集（圖S3）。共鑒定出121185個核心基因，R. ovatum基因組的數(shù)量最多（9847）（圖S2B）。功能富集分析表明，與花的顏色和香味相關(guān)的基因途徑顯著富集，如檸檬烯和蒎烯降解（圖S4）。

3.15個杜鵑屬植物基因組的變異分析

基于以T2T基因組為參考的泛基因組分析，作者對杜鵑花的單核苷酸多態(tài)性（SNPs）、插入和缺失（InDels）以及結(jié)構(gòu)變異（SVs）等變異進行了全面鑒定（圖1I-L，圖S5）。四倍體R. concinnum具有最多的SNP（1876446）和InDels（447281）（圖1I，表S18-19）。功能富集分析表明，含有SNPs和InDels的基因在“碳代謝”和“氨基酸生物合成”途徑中顯著富集。R. concinnum的SV數(shù)量最多，達到7694（表S20）。同時，作者進一步將SVs細分為重復(fù)（DUP）、易位（TRANS）和反轉(zhuǎn)（INV），發(fā)現(xiàn)在大多數(shù)杜鵑屬植物中，前者的數(shù)量超過后者（圖S6-7）。SVs基因與SNPs或InDels基因相比表現(xiàn)出明顯的模式，主要集中在RNA聚合酶和mRNA監(jiān)控途徑上。

4.15個杜鵑花基因組的LTR分析

該研究在15個杜鵑屬物種的全基因組中鑒定了70759個LTR，其中R. griersonianum基因組的LTR數(shù)量最多（7323）（表S21）。作者發(fā)現(xiàn)，在過去的一百萬年中，大多數(shù)杜鵑花物種只經(jīng)歷了一次插入事件的爆發(fā)，而R. delavayi、R. molle和R. williamsianum經(jīng)歷了兩次插入事件的爆發(fā)。兩個事件分別發(fā)生在1.53mya和2.94mya。作者對15個物種的LTR進行聚類，得到每個聚類中的共享LTR。結(jié)果表明，共有2622個LTR聚類，其中R. platypodum最多（531個）。R. liliiflorum中特異性LTRs數(shù)量最多（109個），而R. williamsianum中未發(fā)現(xiàn)物種特異性LTRs。聚類圖顯示，R.williamsianum與其他物種共享LTR的比例最高（圖1M）。此外，LTR在染色體中部的分布密度大于兩端（圖1N）。

5.15個杜鵑屬植物基因組的共線性分析

通過共線性分析，研究發(fā)現(xiàn)15個杜鵑基因組普遍表現(xiàn)出良好的共線性（圖1O）。共線性區(qū)組數(shù)從336個（R. henanense?vs?R. delavayi）到692個（R. irroratum?vs?R. prattii）。此外，還發(fā)現(xiàn)了一些基因組轉(zhuǎn)座現(xiàn)象，如R. ovatum7號染色體的末端區(qū)域與R. simsii和R. henanense。

6.熱反應(yīng)基因的全轉(zhuǎn)錄組測序與檢測

為了探索杜鵑花的耐熱基因和調(diào)控機制，該研究在CK熱處理、3天熱處理（H3）和6天熱處理（H6）條件下進行了全轉(zhuǎn)錄組測序（圖2A，表S22）。共鑒定出50648個mRNAs、17476個lncRNAs、448個miRNAs和6299個circRNAs（圖2B）。此外，在CK、H3和H6處理中，632個mRNAs、21個lncRNAs和6個miRNAs的表達和共享存在差異（圖2C）。

7.候選基因的功能驗證

該研究選擇了兩對具有代表性的miRNAs和相關(guān)靶基因進行功能驗證。熱處理后3h和6h，靶基因表達顯著上調(diào)，小RNA表達顯著下調(diào)。作者進一步研究了miR177對RdbHLH153（Rhdel02G0118700）表達和miR49對RdMYB1R1（Rhdel08G0208700）表達的影響。將螢火蟲熒光素酶分別融合到RdbHLH153和RdMYB1R1的C端，并將miR49和miR177分別插入SK載體（圖2D）。結(jié)果顯示，RdbHLH153中的miR177和RdMYB1R1中的miR49的靶位點略有改變（圖2E）。用RdbHLH153/RdMYB1R1與空SK載體（混合并滲透）或RdbHLH153與miR177（RdMYB1R1和miR49）的混合物對煙草單葉滲透區(qū)進行滲透。均顯示熒光素酶信號的誘導(dǎo)，而R. delavayi中過表達的miR177和miR49可消除RdbHLH153/RdMYB1R1產(chǎn)生的信號（圖2E-G）。

為了進一步研究RdbHLH153和RdMYB1R1在熱脅迫中的作用，采用花浸法獲得了過表達RdbHLH153和RdMYB1R1的轉(zhuǎn)基因擬南芥株系（表S23）。36 h熱處理后，轉(zhuǎn)基因植株的生長明顯優(yōu)于WT（圖2H）。經(jīng)過熱處理后，幼苗恢復(fù)正常狀態(tài)5天，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株轉(zhuǎn)活，WT葉片全部變黃。說明RdbHLH153和RdMYB1R1在提高耐熱性中起重要作用。DAB和NBT染色顯示，與野生型植株相比，RdbHLH153/RdMYB1R1 OE株系中H2O2和O?2的含量顯著降低（圖2I）。

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