Genome Biol | 時空組學(xué)技術(shù)在豬早期卵子發(fā)生階段的應(yīng)用研究

2025年1月，青島農(nóng)業(yè)大學(xué)葛偉教授與沈偉教授團(tuán)隊(duì)在學(xué)術(shù)期刊《Genome Biology》上發(fā)表了一篇題為《Spatiotemporal dynamics of early oogenesis in pigs》的研究論文。該研究利用了單細(xì)胞RNA測序和空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，解析了豬早期卵子發(fā)生中的基因表達(dá)及空間組織特征。研究發(fā)現(xiàn)，豬生殖細(xì)胞在卵巢中呈“皮質(zhì)到髓質(zhì)”分布，且與人類卵子發(fā)生過程相似，表明豬是研究人類卵子發(fā)生的良好模型。RNA速度分析揭示了顆粒細(xì)胞譜系特征，空間共定位分析和細(xì)胞通訊分析顯示皮質(zhì)與髓質(zhì)區(qū)域生殖細(xì)胞與體細(xì)胞通訊模式不同，特別是NOTCH信號通路和ECM蛋白在調(diào)控中起關(guān)鍵作用，強(qiáng)調(diào)了卵巢微環(huán)境對生殖細(xì)胞命運(yùn)的重要性。

文章標(biāo)題：Spatiotemporal dynamics of early oogenesis in pigs

期刊名稱：Genome Biology

影響因子：10.1

合作單位：青島農(nóng)業(yè)大學(xué)

發(fā)表日期：2025.01.02

研究方法：單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組（10x Chromium）、空間轉(zhuǎn)錄組（10x Visium）、高分辨率空間轉(zhuǎn)錄組（BMKMANU S1000）、免疫熒光

百邁客生物為該研究中的E65胚胎卵巢提供了BMKMANU S1000空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)服務(wù)。

 

研究背景

在發(fā)育中的哺乳動物卵巢中，卵泡的位置對其生物學(xué)功能具有重要影響。休眠卵泡主要位于卵巢皮質(zhì)外部，對雌性生育周期長短具有重要影響，而生長卵泡則位于髓質(zhì)區(qū)域，對雌性生育的起始至關(guān)重要。然而，目前對胚胎階段卵巢微環(huán)境形成機(jī)制的理解尚不深入，這主要是由于該過程發(fā)生在胚胎期，涉及多種異質(zhì)細(xì)胞類型的協(xié)同作用。

在小鼠中，原始生殖細(xì)胞從外胚層遷移到生殖脊并在性腺中增殖，隨后在特定時間點(diǎn)沿前后軸異步啟動減數(shù)分裂。最近的研究顯示，這一過程與經(jīng)典的維甲酸信號無關(guān)，而是通過TEX14形成細(xì)胞間橋來實(shí)現(xiàn)。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了生殖細(xì)胞微環(huán)境在決定其發(fā)育命運(yùn)中的關(guān)鍵作用。

目前對卵巢發(fā)育中卵母細(xì)胞的研究主要集中在基因表達(dá)上，但對卵母細(xì)胞在卵泡發(fā)生過程中的細(xì)微空間定位及主要體細(xì)胞類型的空間動力學(xué)特征了解有限。通過空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)和單細(xì)胞RNA測序技術(shù)，該研究揭示了豬早期卵巢發(fā)育中的皮質(zhì)-髓質(zhì)梯度，并發(fā)現(xiàn)人豬之間卵母細(xì)胞空間定位的保守性，進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了卵巢微環(huán)境在決定卵母細(xì)胞命運(yùn)中的重要作用。

 

材料方法

研究材料：通過人工授精培育妊娠豬（三元雜交：Landrace、Large White和Duroc），分別在受精后45、55、65和75天采集胚胎階段的豬卵巢樣本。

研究方法：scRNA-seq（E45、E55、E65、E75胚胎卵巢，共計18,956個高質(zhì)量細(xì)胞，10x Genomics Chromium）；空間轉(zhuǎn)錄組（E45、E55、E65、E75胚胎卵巢，10x Visium；E65胚胎卵巢，BMKMANU S1000）

分析方法：空間轉(zhuǎn)錄組解卷積（Cell2location）；RNA速度分析（Velocyto和scVelo）；單細(xì)胞軌跡推斷（Cellrank）；同源基因轉(zhuǎn)化（biomaRt）；細(xì)胞通訊分析（CellphoneDB、biomaRt、ktplots）；蛋白互作分析；GO富集分析；基因模塊分析（Hotspot）

驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)：免疫熒光；圖像分析和定量分析；Western blotting；卵巢組織體外培養(yǎng)

 

研究結(jié)果

1.豬早期卵子發(fā)生的單細(xì)胞圖譜的構(gòu)建

為了深入揭示豬卵巢早期卵子發(fā)生的時空發(fā)育特征，研究者將單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）與10× Visium空間轉(zhuǎn)錄組（ST）技術(shù)相結(jié)合，對豬卵巢發(fā)育過程中的細(xì)胞空間屬性進(jìn)行了系統(tǒng)分析。4個發(fā)育時間點(diǎn)（E45、E55、E65和E75；scRNA-seq各包括2個胚胎；ST：E45、E55、E65各包括2個胚胎，E75，1個胚胎），其中包括早期卵子發(fā)生的各階段。保留了18,956個高質(zhì)量細(xì)胞，共鑒定出17個聚類，包含9種主要細(xì)胞類型：生殖細(xì)胞、雙潛能前顆粒細(xì)胞、上皮前顆粒細(xì)胞、性腺間質(zhì)細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血管周圍細(xì)胞、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞。

2.豬卵巢空間轉(zhuǎn)錄組的細(xì)胞類型解卷積

為了揭示卵巢發(fā)育過程中不同細(xì)胞類型的空間動態(tài)變化，研究者進(jìn)行了細(xì)胞類型的解卷積分析。盡管scRNA-seq技術(shù)為剖析復(fù)雜組織中的細(xì)胞異質(zhì)性提供了有力工具，但它缺乏細(xì)胞的空間位置信息。因此，研究者采用10× Visium空間轉(zhuǎn)錄組（ST）技術(shù)進(jìn)行測序，以更好地展現(xiàn)豬卵巢發(fā)育過程中不同細(xì)胞類型的空間動態(tài)變化。研究者首先對ST數(shù)據(jù)進(jìn)行了質(zhì)量評估，確保數(shù)據(jù)質(zhì)量符合分析要求。隨后，利用scRNA-seq數(shù)據(jù)作為參考，通過Cell2location算法對ST數(shù)據(jù)進(jìn)行了細(xì)胞類型的解卷積，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞類型的高分辨率定位。

通過解卷積分析，研究者發(fā)現(xiàn)在E45和E55階段，細(xì)胞類型的空間分布相對較為“隨機(jī)”。然而，隨著發(fā)育進(jìn)展到E65階段，研究者觀察到了一個明顯的空間分布模式：生殖細(xì)胞在E45-E55階段隨機(jī)分布在豬卵巢中，而在E65-E75階段則主要定位于皮層區(qū)域，僅有少量位于髓質(zhì)區(qū)域。對于前顆粒細(xì)胞群，我們觀察到了兩種具有不同空間定位模式的細(xì)胞類型：BPG細(xì)胞在E55之前隨機(jī)分布，并逐漸在E75時集中于髓質(zhì)區(qū)域；而EPG細(xì)胞則在整個發(fā)育過程中始終位于卵巢表面。

為進(jìn)一步驗(yàn)證分析結(jié)果，研究者進(jìn)行了全組織染色實(shí)驗(yàn)，使用生殖細(xì)胞標(biāo)志物DDX4和前顆粒細(xì)胞標(biāo)志物KRT19對E45至E75的胎兒卵巢進(jìn)行染色，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與ST數(shù)據(jù)分析結(jié)果一致。此外，研究者還分析了這些陽性細(xì)胞在卵巢背腹軸上的空間分布，并通過熒光強(qiáng)度分析確認(rèn)了生殖細(xì)胞和前顆粒細(xì)胞在皮層和髓質(zhì)區(qū)域的不同分布模式。這些發(fā)現(xiàn)為深入理解豬卵巢發(fā)育過程中細(xì)胞類型的空間動態(tài)變化提供了重要線索。

3.空間尺度解析精細(xì)尺度豬生殖細(xì)胞發(fā)育軌跡

為了深入理解生殖細(xì)胞在空間環(huán)境中的發(fā)育過程，研究者提取了生殖細(xì)胞進(jìn)行重新聚類。通過對生殖細(xì)胞群的精細(xì)分析，研究者發(fā)現(xiàn)了五個對應(yīng)的細(xì)胞簇，分別是有絲分裂生殖細(xì)胞（FGC_mitotic）、表達(dá)MECOM和ATM的前減數(shù)生殖細(xì)胞（Oogonia_STRA8）、表達(dá)SYCP1和DMC1的減數(shù)分裂生殖細(xì)胞（Oogonia_meiotic）、表達(dá)FIGLA和NANOS1的早期卵母細(xì)胞（Pre_oocyte）以及表達(dá)ZP4和ZP3的卵母細(xì)胞（Oocyte）。

為了深入了解早期豬卵母細(xì)胞生成過程中模塊基因的功能富集情況，研究人員采用Hotspot算法，利用生殖細(xì)胞的scRNA-seq數(shù)據(jù)識別了相關(guān)基因模塊，共鑒定出11個功能各異的基因模塊。通過將單個模塊投影到UMAP圖中，確定了具有簇特異性的信息性基因模塊。剖析了早期豬卵母細(xì)胞生成過程中的基因表達(dá)譜后，研究人員進(jìn)一步在空間環(huán)境中研究了這一過程。通過對ST芯片上的生殖細(xì)胞進(jìn)行解卷積，揭示了早期卵母細(xì)胞生成的皮質(zhì)-髓質(zhì)梯度。為了驗(yàn)證上述分析，研究人員使用生殖細(xì)胞標(biāo)記DDX4和減數(shù)分裂生殖細(xì)胞細(xì)線期標(biāo)記γH2AX進(jìn)行了全組織染色實(shí)驗(yàn)，以定位在不同階段啟動減數(shù)程序的生殖細(xì)胞。評估了C-M軸的熒光強(qiáng)度后發(fā)現(xiàn)在E45和E55卵巢中，γH2AX信號沿C-M軸的水平相似，而在E65至E75卵巢中，γH2AX信號在內(nèi)皮層達(dá)到峰值，在髓質(zhì)區(qū)域則減少。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證分析，研究人員還在同一E65卵巢組織上使用了更高分辨率（BMKMANU S1000；Spot點(diǎn)大小約為10微米）的平臺進(jìn)行了ST測序。結(jié)果與E65時的Visium ST解卷積一致，使用S1000平臺在E65時可視化ZP3陽性卵母細(xì)胞的空間位置也證實(shí)了其在內(nèi)皮層的表達(dá)。

綜上所述，研究人員成功地在單細(xì)胞分辨率下再現(xiàn)了豬生殖細(xì)胞的發(fā)育過程，并闡明了豬卵巢組織中生殖細(xì)胞的空間分布模式。

4.跨物種分析揭示了豬與人類之間生殖細(xì)胞基因表達(dá)程序及空間位置模式的保守性

為了深入理解哺乳動物卵母細(xì)胞生成的空間調(diào)控機(jī)制，研究人員進(jìn)行了跨物種分析。研究團(tuán)隊(duì)首先獲取了妊娠后19周人類卵巢的空間轉(zhuǎn)錄組（ST）數(shù)據(jù)，并將其與豬E65時期的ST數(shù)據(jù)進(jìn)行了比較，以分析卵母細(xì)胞生成各階段生殖細(xì)胞的空間位置模式。與人類情況一致的是，生殖細(xì)胞標(biāo)記DDX4與5mC和5hmC的共染色顯示，在E55和E75豬卵巢中，5mC和5hmC信號在DDX4陽性細(xì)胞中不可檢測，且主要在周圍性腺體細(xì)胞中表達(dá)。這些結(jié)果進(jìn)一步揭示，除了保守的基因表達(dá)程序外，人類和豬在早期卵母細(xì)胞生成過程中的表觀遺傳重編程模式也是保守的。

為了研究豬和人類早期卵母細(xì)胞生成過程中皮質(zhì)-髓質(zhì)梯度是否保守，研究人員基于ST數(shù)據(jù)探索了卵母細(xì)胞生成各階段生殖細(xì)胞的空間位置模式。對于早期卵母細(xì)胞階段的生殖細(xì)胞，這些細(xì)胞在卵巢內(nèi)皮質(zhì)區(qū)域有清晰定位，而在人類中，這些細(xì)胞主要位于內(nèi)皮質(zhì)和外髓質(zhì)區(qū)域，且在內(nèi)皮質(zhì)區(qū)域豐度更高。到了卵母細(xì)胞階段，豬和人類中這些生殖細(xì)胞的位置模式相似，主要位于外髓質(zhì)區(qū)域。通過評估生殖細(xì)胞到卵巢表面的相對距離（以卵巢寬度標(biāo)準(zhǔn)化），觀察到豬和人類早期卵母細(xì)胞生成過程均顯示出生殖細(xì)胞的皮質(zhì)-髓質(zhì)梯度定位。這些數(shù)據(jù)不僅揭示了豬和人類早期卵母細(xì)胞生成過程中保守的基因表達(dá)程序和表觀遺傳重編程模式，還強(qiáng)調(diào)了兩種物種在整個早期卵母細(xì)胞生成階段空間動態(tài)的保守性。

5.基于空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)（ST）技術(shù)解析豬卵巢發(fā)育過程中兩種顆粒細(xì)胞譜系的時空特性

在發(fā)育中的卵巢中，顆粒細(xì)胞與生殖細(xì)胞相互作用，形成了卵巢的基本功能單位，即卵泡。因此，研究人員接下來提取了顆粒細(xì)胞譜系，并使用UMAP進(jìn)行了細(xì)胞聚類分析，共鑒定出10個細(xì)胞簇。分析了潛在時間基因表達(dá)動態(tài)和顆粒細(xì)胞前體發(fā)育軌跡中wave II型顆粒細(xì)胞（PreGC_II）的命運(yùn)決定。與PreGC_I相比，簇6和7中的基因在PreGC_II命運(yùn)決定中起關(guān)鍵作用，如WNT6、GREM1和SFRP4，這些結(jié)果共同強(qiáng)調(diào)了WNT信號分子在豬顆粒細(xì)胞前體命運(yùn)決定中的保守作用。此外，ALDH1A2的上調(diào)表明，醛脫氫酶家族成員1A2可能在wave II顆粒細(xì)胞發(fā)育中發(fā)揮重要作用。

使用空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)（ST）技術(shù)對wave I型顆粒細(xì)胞前體（PreGC_I）和wave II型顆粒細(xì)胞前體（PreGC_II）的標(biāo)志性基因進(jìn)行了空間定位。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LHX9（PreGC_I的標(biāo)志）和GREM1（PreGC_II的標(biāo)志）的信號從E45到E75在卵巢中呈現(xiàn)特定的空間分布模式。在E65和E75，GREM1的信號明顯環(huán)繞著DDX4（生殖細(xì)胞的標(biāo)志）的信號，表明卵巢卵泡組裝的早期階段，wave II型顆粒細(xì)胞（來源于皮質(zhì)區(qū)域的顆粒細(xì)胞前體）在卵巢卵泡組裝過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

接下來，研究人員分析了顆粒細(xì)胞譜系的空間特性，進(jìn)行了細(xì)胞類型反卷積，并觀察到卵巢表面上皮（OSE）細(xì)胞群主要位于豬卵巢的表面，并隨著發(fā)育的進(jìn)行細(xì)胞數(shù)量增加。在E45時，I型顆粒細(xì)胞前體（PreGC_I）細(xì)胞廣泛分布在髓質(zhì)中，部分位于皮質(zhì)中；在E65時，觀察到I型顆粒細(xì)胞前體（PreGC_I）和II型顆粒細(xì)胞前體（PreGC_II）分別呈現(xiàn)出特定的皮質(zhì)和髓質(zhì)分布模式。通過免疫熒光分析進(jìn)一步驗(yàn)證了這些發(fā)現(xiàn)，上述結(jié)果共同揭示了豬卵巢發(fā)育過程中顆粒細(xì)胞譜系的空間時間特性。

6.豬卵巢發(fā)育期間主要體細(xì)胞類型的空間特性

除了生殖細(xì)胞和顆粒細(xì)胞外，研究人員還進(jìn)一步以更高分辨率分析了GI（間質(zhì)細(xì)胞）和Sm（平滑肌細(xì)胞）這兩種體細(xì)胞在豬卵巢中的空間分布模式，因?yàn)檫@兩種細(xì)胞類型在豬卵巢中顯示出特征性分布，表明它們可能在塑造卵巢微環(huán)境方面發(fā)揮作用，這對早期卵子發(fā)生至關(guān)重要。

將GI和Sm的標(biāo)記基因整合到空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)中，觀察到這些體細(xì)胞的空間位置隨著從E45到E75的發(fā)育進(jìn)展而發(fā)生變化。通過RNA速度分析確定的分化譜系細(xì)胞和增殖狀態(tài)細(xì)胞在E45和E55時的卵巢中隨機(jī)分布，而在E65時，觀察到這些細(xì)胞在卵巢皮質(zhì)中呈現(xiàn)出明顯的空間聚集模式，特別是在生殖細(xì)胞附近。這些發(fā)現(xiàn)共同揭示了豬卵巢發(fā)育早期體細(xì)胞空間位置模式的動態(tài)變化，表明它們在形成對早期卵子發(fā)生至關(guān)重要的卵巢微環(huán)境中發(fā)揮潛在作用。

7.空間共定位分析揭示了皮質(zhì)區(qū)和髓質(zhì)區(qū)存在截然不同的微環(huán)境，強(qiáng)調(diào)了其在調(diào)控生殖細(xì)胞命運(yùn)中的關(guān)鍵作用

在闡明了發(fā)育中的豬卵巢中主要細(xì)胞類型的時空特征后，研究人員接下來研究了空間微環(huán)境的變化如何影響發(fā)育中卵巢的細(xì)胞命運(yùn)決定。首先對細(xì)胞類型豐度進(jìn)行了非負(fù)矩陣分解（NMF），以研究發(fā)育中卵巢中細(xì)胞的空間共定位。NMF分解的應(yīng)用成功地表征了位于皮質(zhì)和髓質(zhì)的生殖細(xì)胞niche，并揭示了與不同空間來源的生殖細(xì)胞共定位的體細(xì)胞。為了全面理解細(xì)胞-細(xì)胞通信模式的功能性，研究人員使用CellphoneDB進(jìn)行GO富集分析，識別了不同區(qū)域生殖細(xì)胞與體細(xì)胞之間的配體-受體（L-R）對，發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)和髓質(zhì)區(qū)域之間細(xì)胞-細(xì)胞通信模式的功能富集結(jié)果不同。

此外，研究人員觀察到皮質(zhì)區(qū)域的L-R對顯著富集了NOTCH信號通路，PreGC_ii0和PreGC_ii8表達(dá)NOTCH信號介導(dǎo)因子NOTCH2，而其配體DLK1和JAG1則在向減數(shù)分裂進(jìn)程中的生殖細(xì)胞中表達(dá)，結(jié)果表明NOTCH2在豬早期生殖細(xì)胞命運(yùn)決定中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在髓質(zhì)區(qū)域細(xì)胞-細(xì)胞通信分析揭示了在卵細(xì)胞階段的生殖細(xì)胞表達(dá)了參與原始卵泡組裝的配體，包括BMP4和BDNF，而它們相應(yīng)的受體，包括BMPR1A、BMPR1B和SORT1，則由PreGC i4和PreGC i7表達(dá)。研究人員發(fā)現(xiàn)髓質(zhì)區(qū)域的體細(xì)胞表達(dá)了一系列細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）蛋白，而皮質(zhì)區(qū)域則不是這樣，表明ECM蛋白在調(diào)節(jié)豬卵母細(xì)胞生成中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證細(xì)胞通訊分析，研究人員接下來探討了在使用從E55卵巢皮質(zhì)和髓質(zhì)中分離的卵巢組織進(jìn)行體外條件下，補(bǔ)充NOTCH信號抑制劑DAPT和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑多西環(huán)素是否會影響生殖細(xì)胞命運(yùn)。從E55胎兒卵巢中解剖出皮質(zhì)和髓質(zhì)組織，將這些組織進(jìn)行體外培養(yǎng)，并在用DAPT處理10天后觀察到皮質(zhì)卵巢組織中減數(shù)分裂標(biāo)志物STRA8的表達(dá)水平顯著降低，而髓質(zhì)卵巢組織則沒有這種情況。相反，在用基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑多西環(huán)素處理10天后，觀察到卵泡形成標(biāo)志物L(fēng)HX8的表達(dá)水平降低，而在皮質(zhì)組織中未觀察到可比的影響。綜上所述，這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步支持了在空間背景下的細(xì)胞-細(xì)胞通訊分析，并強(qiáng)調(diào)了卵巢微環(huán)境在調(diào)節(jié)生殖細(xì)胞命運(yùn)中的重要作用。

 

研究總結(jié)

綜上所述，該研究基于單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組測序，深入探討了豬早期卵子發(fā)生過程中的時空基因表達(dá)譜和卵巢微環(huán)境的空間組織，以及這些特征在人類中的保守性。這些發(fā)現(xiàn)不僅豐富了我們對豬繁殖性狀形成復(fù)雜機(jī)制的認(rèn)識，還為生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究提供了新的視角和方法。