IF=26.8 | 北京大學合作團隊發(fā)表重要研究成果！

甲狀腺激素受體-β (THR-β) 激動劑 MGL-3196 作為代謝功能障礙相關脂肪性肝炎 (MASH) 藥物，然而其個體臨床療效差異較大，并與宿主肝腸循環(huán)中的微生物組存在相互作用，目前其對宿主肝腸循環(huán)中腸道菌群的干擾尚不明確。

2024年8月21日，北京大學崔一民、安徽醫(yī)科大學王華教授共同通訊在Journal of Hepatology期刊在線發(fā)表題為“Thyroid hormone receptor-beta agonist HSK31679 alleviates MASLD by modulating gut microbial sphingolipids”的研究論文。研究團隊運用宏基因組、單細胞轉錄組和代謝組組學研究了甲狀腺激素受體-β激動劑HSK31679在改善代謝相關脂肪性肝炎（MASH）方面的作用，并探究了腸道菌群在其中扮演的角色。研究發(fā)現(xiàn)，HSK31679能夠有效改善SPF小鼠的MASH，但無菌小鼠則沒有這種效果，說明腸道菌群在HSK31679的治療中起到了關鍵作用。研究還發(fā)現(xiàn)，HSK31679能夠增加腸道擬桿菌thetaiotaomicron的相對豐度，并抑制其萄糖神經酰胺合成酶（GCS）活性，從而減少腸道微生物鞘脂的單糖基化，進而改善肝臟脂肪積累。此外，HSK31679還能夠重塑髓系細胞動態(tài)，使其向抗炎微環(huán)境轉變，從而進一步減輕MASH。

文章標題：Thyroid hormone receptor-beta agonist HSK31679 alleviates MASLD by modulating gut microbial sphingolipids

發(fā)表期刊：Journal of Hepatology

影響因子：26.8

合作單位：北京大學

研究對象：小鼠模型、臨床隊列

研究方法：微生物多樣性測序，宏基因組測序，代謝組檢測

百邁客生物為該研究提供了微生物多樣性測序，宏基因組測序，代謝組檢測服務。

研究背景

甲狀腺激素受體-β (THR-β) 激動劑，如 MGL-3196 和 HSK31679，因其對 THR-β 的選擇性高而被認為是治療 MASH 的新興藥物。MGL-3196在臨床試驗中表現(xiàn)出良好的療效，但其個體臨床療效差異較大，且存在腸道通透性差的問題。HSK31679 是 MGL-3196 的衍生物，其療效和安全性正在進一步研究中。腸道微生物組與宿主的代謝健康密切相關，其組成和功能的改變與 MASH 的發(fā)生發(fā)展密切相關。腸道微生物可以產生多種酶，參與宿主血漿脂質代謝，并可能影響 THR-β 激動劑的活性。該研究旨在探索腸道微生物在 THR-β 激動劑治療 MASH 中的作用，評估 HSK31679 的療效和機制以及為 MASH 的治療提供新的思路和靶點。

材料方法

1.動物實驗

對無菌小鼠和 SPF 小鼠進行高脂飲食誘導的 MASH 模型構建，分別給予 MGL-3196 和 HSK31679 治療，觀察肝脂肪變性程度和肝臟指標變化。

對 SPF 小鼠進行?B. thetaiotaomicron 菌株定殖，觀察 HSK31679 對 MASH 模型的影響。

2.微生物組分析：

對參與者的糞便進行宏基因組測序，分析腸道菌群組成變化。

對參與者的糞便和血清進行脂質組學分析，檢測腸道微生物產生的鞘脂類物質變化。

3.單細胞 RNA 測序：

對18例PBMC樣本進行單細胞轉錄組測序，分析 HSK31679 對免疫細胞的影響。

研究結果

1.HSK31679 在 SPF 小鼠中優(yōu)于 MGL-3196 治療高脂飲食誘導的 MASH

為了研究THR-β激動劑治療 MASH對腸道微生物群的影響，研究者在沒有腸道微生物定群的情況下飼養(yǎng)的C57 BL/6 GF小鼠喂食高脂肪、果糖和膽固醇飲食（MASH飲食）和SPF對照組16周。然后每日給予MGL-3196或HSK 31679 3毫克/kg劑量，口服，持續(xù)8周（圖1A）。如圖1B所示，MGL-3196灌胃對SPF和GF小鼠的體重均沒有明顯影響，而HSK 31679導致SPF小鼠的體重增加具有統(tǒng)計學意義，但GF小鼠沒有。服用MASH飲食然后接受MGL- 243 3196/HSK 31679處理的SPF小鼠表現(xiàn)出肝臟重量明顯下降（p < 0.01;圖1C），HSK31679 組 SPF 小鼠的體重增加、肝臟重量、血清和肝臟甘油三酯和膽固醇水平、血清 ALT、AST 和 GGT 水平以及肝臟脂質變性程度均顯著低于 MGL-3196 組。HSK31679 組 SPF 小鼠的肝臟炎癥和纖維化相關基因表達水平也顯著低于 MGL-3196 組。無菌小鼠模型中，MGL-3196 和 HSK31679 組的 MASH 病理表現(xiàn)相似，表明 HSK31679 的療效依賴于腸道菌群。

2.HSK31679 治療增加了腸道 B. thetaiotaomicron?的相對豐度

在MASH飲食喂養(yǎng)16周和HSK31679治療8周后，觀察到SPF小鼠富含腸道擬桿菌thetaiotaomicron（B. thetaiotaomicron）（圖1I、J和S2D）。NMDS和PCA分析表明HSK31679重塑了β多樣性譜，而每組腸道微生物群的Shannon和Simpson多樣性指數(shù)略有差異（圖S2G和H）。在微生物功能方面，通過KEGG分析富集的7,458條功能途徑。其中22條途徑在HSK31679治療后有所不同，包括參與激活神經鞘脂（SL）代謝的途徑，在HSK31679實驗組中，B. thetaiotaomicron與上調的己糖神經酰胺加工基因密切相關（圖1L）。

為了臨床驗證微生物組組成的這種轉變，研究者收集了40名健康參與者的糞便樣本，這些參與者接受了每周3次的HSK31679多次遞增劑量治療，持續(xù)14天。對參與者的糞便進行宏基因組測序分析，鑒定了代表183個科和119個屬的415種微生物物種。香農和辛普森多樣性指數(shù)在兩組中幾乎沒有受到HSK31679治療的影響（圖S3A和B）。相比之下，PCA評分和NMDS均顯示了HSK31679處理14 d后腸道微生物群β多樣性譜的顯著變化。對51個不同的細菌屬進行屬級微生物Spearman相關網(wǎng)絡分析，發(fā)現(xiàn)HSK31679處理后有幾個屬與擬桿菌屬呈正相關（圖S3D）。

隨后通過LEfSe分析探索了HSK31679治療組14天與安慰劑組相比的腸道菌群差異，這進一步揭示了桿菌屬的最大增量（圖2B，C）。值得注意的是，在第14天上升劑量為80mg、120mg、160mg HSK31679后，B. thetaiotaomicron的相對豐度表現(xiàn)出最明顯的逐漸上升（圖2C），并通過qPCR進行了驗證（圖2D），這表明B.thetaiotaomicron可能在HSK31679治療期間發(fā)揮關鍵中介作用。KEGG通路分析富集了20個信號通路的154個功能基因，其中神經酰胺代謝被HSK31679處理激活（圖2E）。這些顯著的成分變化與以前對晚期脂肪性肝炎患者微生物種群負相關的研究一致。

3.HSK31679 治療抑制了?B. thetaiotaomicron?產生的鞘脂類物質的單糖基化過程

基于 B. thetaiotaomicron?的 SLs 可以轉移以調節(jié)肝臟脂肪變性這一認識，隨后研究者試圖確定 HSK31679 314 治療是否已深入調節(jié) SLs 表型。對接受多次遞增劑量 HSK31679 316 和安慰劑治療的參與者的糞便代謝物進行脂質組學分析，發(fā)現(xiàn)?HSK31679 治療顯著降低了腸道 B. thetaiotaomicron?產生的鞘脂類物質（如 Hex1Cer 和 Hex2Cer）的單糖基化程度。

HSK31679 治療組的腸道菌群與鞘脂類物質之間存在顯著的負相關關系，HSK31679 治療的綜合統(tǒng)計相關性分析證實，擬桿菌和普雷沃氏菌與 C16:0 和 C24:1 ?；湹募禾巧窠涻０烦守撓嚓P（圖 3D）。這表明口服 HSK31679 治療可抑制微生物對神經酰胺的單糖基化。

4.thetaiotaomicron 的 GCS 活性對 HSK31679 減輕 MASH 的作用至關重要

進一步研究了HSK 31679介導的SLs 單糖基化的潛在機制。通過體外共培養(yǎng)實驗和體內無菌小鼠模型，發(fā)現(xiàn) HSK31679 治療抑制了 B. thetaiotaomicron?的 GCS 活性。在無菌小鼠模型中，B. thetaiotaomicron?GCS 活性缺失的小鼠對 MGL-3196 和 HSK31679 的療效沒有顯著差異，而 GCS 活性存在的小鼠對 HSK31679 的療效顯著優(yōu)于 MGL-3196。HSK31679 與 B. thetaiotaomicron GCS?的結合結構分析表明，HSK31679 通過空間位阻效應抑制了 GCS 的活性。

5.HSK31679治療的單細胞圖譜

為了深入了解腸道微生物GCS在所有免疫細胞群中治療HSK31679的獨特免疫作用，研究者使用基于液滴的單細胞平臺（10×Genomics Chromium）進行了單細胞轉錄組測序（scRNA-seq），分析了來自參與者隊列的18個外周血單核細胞（PBMC）樣本，包括3個用安慰劑（GH-PL）治療的糞便來源GCS高活性樣本、3個用160 mg HSK31679（GH-HS）治療的糞便來源GCS高活性樣本，和GCS低活性樣本（GL-HS）分別在第0天和第14天。從GH-PL、GH-HS、GL-HS數(shù)據(jù)集中獲得的128031個細胞中，共鑒定出57個細胞簇。通過SingleR v.1.0獲得的基于標記的注釋，定義了四種主要的細胞類型：T細胞、自然殺傷細胞（NK）和B細胞、髓系細胞、內皮細胞（EC）和間充質細胞（圖5B）。通過計算觀察到的細胞數(shù)與預期細胞數(shù)的比值（Ro/e）來量化主要細胞團相對不同的富集情況，發(fā)現(xiàn)髓系細胞團構成了GH-HS的主要改變的細胞成分，B細胞、EC團主導了GL-HS樣本的細胞成分（圖5C、D和圖S8C）。鑒于如上所述，HSK31679治療通過B.thetaiotaomicron的GCS減輕了脂肪性肝炎，在隨后分析GH-HS和GL-HS之間的特定細胞區(qū)室時重點研究了髓系細胞。

6.HSK31679 治療重塑了髓系細胞的動態(tài)變化，使其趨向于抗炎微環(huán)境

在所有髓系細胞亞群中，樹突狀細胞 (DC) 和巨噬細胞 (Mφ) 構成了主要細胞類型（圖 5B）。通過無監(jiān)督聚類，首先關注 DCs 群體的內在屬性和潛在功能，這些 DCs 群體被確定為減少的 CD8α+DCs（圖 6A、D）。值得注意的是，GH-HS 組中 Tregs 的 IL-12Rβ2 可以與 CD8α+DCs 衍生的 IL-35 相互作用（圖 6B、C）。如先前報道的那樣，可以增強炎癥過程的抑制功能。與GL-HS或GH-PL數(shù)據(jù)集相比，GH-HS的PBMCs中CD4+Foxp3+Tregs的數(shù)量增加（圖6D）。這些Tregs的抑制功能阻斷了IL-35的EBI3亞基的作用（圖6E），導致免疫原性顯著受損。這可能是由于STAT1/STAT3的異常激活和p38 MAPK/NF-κB信號通路的抑制（圖S8D和E）。此外，注意到DC簇的分布與γ-谷氨酰轉移酶（GGT）的表達相關（圖6B），GGT是MASH進展的公認血清生物標志物。在GH-HS的所有DC中（圖6A），GGT+樣本中CD1C+DCs（cDC2）的比例顯著增加，而與GL-HS或GH-PL組相比，DEC205+DCs（cDC1）的比例降低。盡管之前的研究報告了cDCs在促進或抑制脂肪性肝炎中的不確定作用，但結果表明，cDC1和cDC2細胞對HSK31679治療的反應方式相反。

對于巨噬細胞部分，通過無監(jiān)督聚類產生了6個具有不同基因特征的聚類。對兩個富含非經典單核細胞簇的PBMCs進行了表征：MINCLE+Mφ和S1PR2+Mφ。根據(jù)常規(guī)表型標記物（TREM2+、MRC1+、CD163+、AGR1+）的高表達，其余簇均被鑒定為巨噬細胞（圖6A）。值得注意的是，巨噬細胞簇MINCLE+Mφ、S1PR2+Mφ和AGR1+Mφ顯示出相對不同的發(fā)展（圖6F、G）。在這些巨噬細胞簇中，AGR1+Mφ和MINCLE+Mφ是GH-HS和GL-HS組中改變的主要亞群，而S1PR2+Mφ在GH-HS組更具特征（圖5C）。然后研究了它們的不同功能狀態(tài)，并觀察到趨化因子（CCL3/15和CXCL10/12/14）在GH-HS中的表達降低，但在GL-HS樣本中沒有，這表明其是由這些Mφ簇募集T細胞的過程。GH-HS樣本的細胞相互作用分析也證實，抗炎巨噬細胞通過CCL3/15-CCR5、CXCL10/11-CXCR5和CXCL12/14-CXCR4信號傳導積極參與T細胞的募集（圖6C和S9B）。在GL-HS組中，MRC1+Mφ表達的CCL15/CXCL10水平升高，AGR1+Mφ高度表達CCL2/CXCL12（圖S9B）；而GH-HS組CCL22簇的優(yōu)勢Mφ從MINCLE+Mφ切換（圖6H和S9D），其AGR1+Mφ上調了RPS27、CDKN1C和KLRF1的表達水平（圖S10B），表明經HSK31679處理的糞便來源GCS+參與者的巨噬細胞發(fā)生了重編程?？偨YHSK31679治療的上述代謝指標，GCS活性和糞便中B.thetaiotaomicron的相對豐度與肝臟ΔTG、ΔTC和ΔGGT水平等呈顯著負相關（圖6I）。這些結果表明，B.thetaiotaomitron介導的免疫抑制的GCS活性可能預測HSK31679治療個體的MASH緩解。

研究總結

該研究描繪了HSK31679通過抑制腸道微生物鞘脂的單糖基化來改善MASH的新圖譜。這項研究為腸道微生物和循環(huán)免疫因素提供了新的見解，這些因素可以作為MASH患者HSK31679治療的預后標志物，以及基于腸道微生物群的MASLD治療的新靶點或策略。對于甲狀腺模擬物的進一步4期上市后研究，應系統(tǒng)地調查大規(guī)模隊列，研究抗菌組合對MASH個體長期結果的影響。

文章亮點

該研究證明了腸道微生物在 THR-β 激動劑治療 MASH 中的重要作用。發(fā)現(xiàn) HSK31679 通過抑制腸道 B. thetaiotaomicron?產生的鞘脂類物質的單糖基化過程來減輕 MASH。揭示了腸道 GCS 活性可以作為 HSK31679 治療 MASH 的預測生物標志物。發(fā)現(xiàn) HSK31679 治療重塑了髓系細胞的動態(tài)變化，使其趨向于抗炎微環(huán)境。

參考文獻：

Zhang YH, Xie R, Dai CS, et al. Thyroid hormone receptor-beta agonist HSK31679 alleviates MASLD by modulating gut microbial sphingolipids. J Hepatol.?Published online August 22, 2024. doi:10.1016/j.jhep.2024.08.008