Hortic Res | 凱里學(xué)院和貴州植物園在紅色覆盆子基因組組裝及花青素生物合成研究取得新進(jìn)展

2024年3月17日，凱里學(xué)院和貴州植物園在國際學(xué)術(shù)期刊Horticulture Research發(fā)表一項(xiàng)重要研究成果，題為：Chromosome-scale genome, together with transcriptome and metabolome, provides insights into the evolution and anthocyanin biosynthesis of?Rubus rosaefolius Sm.?(Rosaceae)。該研究通過基因組、轉(zhuǎn)錄組和代謝組的方法解析薔薇科空心藨進(jìn)化和花青素合成機(jī)制。

文章標(biāo)題：Chromosome-scale genome, together with transcriptome and metabolome, provides insights into the evolution and anthocyanin biosynthesis of?Rubus rosaefolius Sm.?(Rosaceae)

期刊名稱：Horticulture Research

影響因子：7.6

合作單位：凱里學(xué)院和貴州植物園

研究對(duì)象：薔薇科空心藨

研究方法：基因組、轉(zhuǎn)錄組和植物廣靶代謝組學(xué)等

百邁客生物為該研究提供了基因組、轉(zhuǎn)錄組和植物廣靶代謝組檢測(cè)和分析服務(wù)。

研究背景

薔薇屬(薔薇科)有12個(gè)亞屬，700余種，除南極洲外分布在世界各地。薔薇屬植物的組織，尤其是成熟的漿果，通常含有多種促進(jìn)健康的化合物(如花青素、酚酸和類黃酮)和營養(yǎng)物質(zhì)(如纖維素、維生素E和天然色素)。自古以來，它們就被用作藥物和水果。

空心藨(Rubus rosifolius Sm.)是一種天然生長在東亞、東南亞、南亞、大洋洲、非洲和馬達(dá)加斯加的紅色覆盆子?？招乃懙闹?、葉、根長期以來被用于止咳、祛風(fēng)、止血、濕。成熟的薔薇果實(shí)含有豐富的花青素、酚類物質(zhì)、三萜、甾醇等生物活性成分。因此，它具有多種藥理作用，包括抗氧化、鎮(zhèn)痛、抗菌、防腐、抗增殖、抗癌、利尿、降壓等。此外，成熟的薔薇果實(shí)具有獨(dú)特的酸甜味道，顏色鮮艷，很有吸引力。綜上所述，薔薇是一種吸引人的野果，具有很高的商業(yè)價(jià)值，因此具有很大的馴化和栽培潛力。

實(shí)驗(yàn)材料

該研究以貴州植物園覆盆子種質(zhì)苗圃種植的一株薔薇為研究對(duì)象，進(jìn)行了基因組、轉(zhuǎn)錄組和代謝組實(shí)驗(yàn)。對(duì)幼葉進(jìn)行基因組DNA提取分析。幼葉、幼莖、幼根、花萼、花瓣、雄蕊和3個(gè)幼果，發(fā)育天數(shù)分別為5、8和11天，三種著色漿果，分別發(fā)育14、17和19天，對(duì)發(fā)育21、23和25天的3個(gè)成熟果實(shí)進(jìn)行RNA提取，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析。同樣的漿果也被用來進(jìn)行植物廣靶代謝組分析。

研究結(jié)果

1.基因組分析——基因組草圖組裝與注釋

該研究首先構(gòu)建并測(cè)序了空心藨的短讀文庫(350 bp)，獲得了59.76 Gb的數(shù)據(jù)和97.53%的合格reads (>Q20)。K-mer分析，估計(jì)空心藨基因組大小為220.50 Mb，重復(fù)率為33.31%，雜合度為1.64%。然后，構(gòu)建空心藨長讀文庫并進(jìn)行測(cè)序，組裝成241.76 Mb的基因組草圖，由141個(gè)連續(xù)序列(contigs)組成(N50 = 15.36 Mb)。最后，構(gòu)建并測(cè)序了空心藨的Hi-C文庫，獲得了> 1.65億個(gè)讀對(duì)。

利用這些有效的互作讀對(duì)對(duì)初步的基因組草圖進(jìn)行校正，得到了總共221.95 Mb的最終草圖，包含138個(gè)contigs (N50 = 16.13 Mb)。這些contigs進(jìn)一步聚集成131個(gè)支架(N50 = 30.0 Mb)。70個(gè)支架共219.02 Mb，占總組裝序列的98.68%，占估計(jì)基因組大小的99.33%，錨定在7條假染色體上。其中，20個(gè)支架(211.23 Mb)的位置和方向被確定，占錨定序列的96.44%。通過blast of essential genes (CEG)數(shù)據(jù)庫和BUSCO數(shù)據(jù)庫來估計(jì)該草圖基因組的組裝完整性，共鑒定出458個(gè)CEG的456個(gè)同源物(99.56%)和1614個(gè)BUSCO的1590個(gè)同源物(98.51%)。這些結(jié)果表明，組裝的空心藨基因組草圖具有較高的完整性。綜合各組組或支架的組裝完整性、無間隙度、N50等指標(biāo)，該研究組裝的草圖基因組超過了其他覆盆子物種。

從空心藨基因組組裝草圖中，通過從頭算預(yù)測(cè)、同源性預(yù)測(cè)和RNA-seq預(yù)測(cè)相結(jié)合，共鑒定出28067個(gè)蛋白編碼基因，在這些預(yù)測(cè)的基因中，1584個(gè)(98.14%)與BUSCOs(1614)同源，26173個(gè)(93.25%)可以被注釋為具有生物學(xué)或分子功能，這些帶注釋的轉(zhuǎn)座元件和蛋白質(zhì)編碼基因不均勻地分布在紅花的染色體上(圖1)。從紅花草圖基因組中鑒定了1500多個(gè)RNA基因，主要是rRNA和tRNA基因，以及一些假基因。

2.基因組分析——薔薇與其他9種植物的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系及基因家族分析

為了研究空心藨的進(jìn)化關(guān)系，該研究分析比較了玫瑰、黃連、鵝掌楸、水稻、擬南芥、月季、花薔薇、桃李、中國栗、西方栗的基因集數(shù)據(jù)。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，薔薇科出現(xiàn)在白堊紀(jì)，覆盆子出現(xiàn)在古近紀(jì)，空心藨和另一種紅覆盆子R. chingii在1728-3644萬年前(mya)從最近的共同祖先分化而來，隨后空心藨的211個(gè)基因家族和36個(gè)基因家族分別擴(kuò)張和收縮(圖2)，這些擴(kuò)展家族中的基因主要富集于代謝途徑，如“DNA聚合酶”、“光合作用”、“晝夜節(jié)律”和“半乳糖代謝”。

3.基因組分析——基因組共線性分析和重復(fù)事件分析

所有的植物都有一個(gè)或遠(yuǎn)或近的共同祖先。通過共線性分析發(fā)現(xiàn)：在1號(hào)染色體的一端和其他6條染色體上，發(fā)現(xiàn)了完整且平行的同源物，但在1號(hào)染色體的另一端缺失了大同源塊(圖3a)。這些結(jié)果表明，空心藨和紅覆盆子之間沒有發(fā)生大的染色體變異，但在空心藨和紅覆盆子基因組草圖的組裝或注釋中隱藏了錯(cuò)誤。該研究發(fā)現(xiàn)，空心藨和紅覆盆子之間所有染色體的共線性幾乎是完整的(圖3b)，這表明上述1號(hào)染色體的組裝或注釋錯(cuò)誤可能在空心藨中沒有發(fā)生。當(dāng)忽略單倍型中支架組裝方向的干擾時(shí)，1、2、3、5、7號(hào)染色體幾乎完全平行共線性，4號(hào)染色體可能發(fā)生較大反轉(zhuǎn)，6號(hào)染色體可能發(fā)生3次或更少的反轉(zhuǎn)(圖3b)。這些發(fā)現(xiàn)表明，隨著親緣關(guān)系距離的增加，復(fù)雜染色體變異的數(shù)量增加。

全基因組復(fù)制(WGD)分析發(fā)現(xiàn)。薔薇科其他成員與西方薔薇科同屬的共同祖先曾發(fā)生過WGD事件。

4.代謝組分析——漿果中花青素及其積累動(dòng)態(tài)

已有研究表明，空心藨漿果中含有豐富的花青素，特別是矢車菊素和天竺葵素。該研究利用植物廣靶代謝組技術(shù)鑒定到1330種代謝物，包括121種氨基酸和衍生物、248種酚酸、241種黃酮類、78種生物堿和151種萜類和有機(jī)酸。在黃酮類化合物中，有17種花青素在9種不同時(shí)期的漿果中檢測(cè)到，幼齡期(N1)、著色期(N2)和成熟期(N3)分別有3個(gè)、3個(gè)和3個(gè)。在N1向N2(發(fā)育期)過渡期間，總花青素和大多數(shù)種類花青素的濃度保持相對(duì)穩(wěn)定，只有天竺葵素-3- O-葡萄糖苷、天竺葵素-3-木糖苷和天竺葵素-3-O -(6’’- O -丙二?；?葡萄糖苷繼續(xù)增加(圖5)，N2 ~ N3(發(fā)育階段)5種花青素(天竺葵素-3-O- (6 ’’-O-乙?；?糖苷和芍藥色素-3-O-糖苷)濃度保持相對(duì)穩(wěn)定，2種花青素(天竺葵素-3-O-蘆丁苷和飛燕草素- 3-O-(6’’-O-咖啡酰)糖苷)濃度略有下降，此外，總花青素和其他10種花青素均呈上升趨勢(shì)。8種(如天竺葵素-3- O -半乳糖苷和天竺葵素-3- O (6’’-O -乙酰基)葡萄糖苷)略有增加，2種(天竺葵素-3- O -(6’’-O-丙二?；?葡萄糖苷)急劇增加(圖5)，這些結(jié)果表明，空心藨花青素的產(chǎn)生主要發(fā)生在成熟階段，其主要貢獻(xiàn)物質(zhì)是紅色色素天竺葵素3-O -葡萄糖苷和天竺葵素3- O -(6’’ -O-丙二?；??葡萄糖苷。

5.轉(zhuǎn)錄組分析——花青素生物合成相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因

轉(zhuǎn)錄組共鑒定出23997個(gè)基因在空心藨果實(shí)中不同水平表達(dá)。根據(jù)KEGG注釋，共鑒定出11個(gè)結(jié)構(gòu)基因，其中花青素3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(RrBZ1)基因6個(gè)，分屬于5個(gè)家族，2個(gè)花青素3-O-葡萄糖苷2’’-O-木糖基轉(zhuǎn)移酶(RrUGT79B1)基因?qū)儆谝粋€(gè)家族，1個(gè)花青素3- O-葡萄糖苷5-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(RrUGT75C1)基因和2個(gè)花青素3-O-葡萄糖苷6’-O-?；D(zhuǎn)移酶(Rr3AT)基因?qū)儆趦蓚€(gè)家族，參與了“花青素生物合成”途徑。此外，該研究還鑒定出22個(gè)結(jié)構(gòu)基因，其中查爾酮異構(gòu)酶(RrCHI)基因10個(gè)，屬于6個(gè)家族，5個(gè)查爾酮合成酶(RrCHS)基因，屬于4個(gè)家族，4個(gè)雙功能flavanol 4-還原酶/flavanone 4-還原酶(RrDFR)基因，分屬于3個(gè)家族，一個(gè)類黃酮3’-單加氧酶(RrCYP75B1)基因，一個(gè)柚皮素3-雙加氧酶(RrF3H)基因，和一個(gè)花青素合成酶(RrANS)基因，參與“類黃酮生物合成”，在花青素生物合成中起著至關(guān)重要的上游作用。在這33個(gè)結(jié)構(gòu)基因中，Rro07G000520.1 (RrBZ1)、Rro04G036130.1 (RrBZ1)、Rro01G021400.1 (RrF3H)、Rro07G031240.1 (RrDFR)、Rro04G035990.1 (RrCHS)、Rro04G036130.1 (RrCHS)、Rro07G006550.1 (RrCHI)和Rro05G014010.1 (RrANS)在漿果組織中表達(dá)量相對(duì)較高(圖6)。該研究推測(cè)這8個(gè)基因是參與空心藨花青素生物合成的主要基因。共有33個(gè)結(jié)構(gòu)基因在空心藨的花、葉和根組織中表達(dá)，但沒有一個(gè)在漿果中表達(dá)。這一發(fā)現(xiàn)表明，花青素代謝存在于空心藨的各個(gè)組織中，并不是單獨(dú)存在于果實(shí)中。

6.聯(lián)合分析——花青素生物合成的基因調(diào)控

為了探索空心藨紅漿果中花青素生物合成調(diào)控的分子機(jī)制，該研究對(duì)空心藨紅漿果幼齡期和成熟期的轉(zhuǎn)錄組和代謝組進(jìn)行了相關(guān)性分析。在成熟漿果中發(fā)現(xiàn)的主要花青素——芍藥苷-3-O-葡萄糖苷和芍藥苷-3-O-(6’’-O-丙二?；?葡萄糖苷被鑒定為顯著差異積累代謝產(chǎn)物(DAMs)，其中11個(gè)結(jié)構(gòu)基因被發(fā)現(xiàn)為差異表達(dá)基因(DEGs)。其中，Rro07G000520.1 (RrBZ1)、rro07g035990.1和rro07g036130.1 (RrCHS)、rro07g06550.1 (RrCHI)、rro07g021400.1 (RrF3H)、Rro07G031240.1 (RrDFR)和Rro05G014010.1 (RrANS)與芍藥苷-3-O-葡萄糖苷積累呈正相關(guān)，而Rro07g033620.1、Rro07g024760.1 (RrBZ1)、Rro07G009270.1 (RrUGT75C1)、Rro04G021540.1 (RrUGT79B1)與這兩種物質(zhì)呈負(fù)相關(guān)(圖6b)。編碼屬于MYB、bHLH、AP2、bZIP、NAC和TCP家族轉(zhuǎn)錄因子的幾個(gè)DEGs的表達(dá)與上述一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)基因和兩個(gè)DEGs呈顯著正相關(guān)或負(fù)相關(guān)(圖6b)。這些發(fā)現(xiàn)表明轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與了空心藨花青素生物合成的調(diào)控。通過蛋白-蛋白相互作用(PPI)分析，該研究發(fā)現(xiàn)Rro4G033620蛋白(RrBZ1)與三甲基鳥苷合成酶1 (RrTGS1)直接相互作用，Rro5G003920蛋白(RrBZ1)直接與鐵氧還蛋白C1 (RrFDX1)、CCAAT結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子(RrNFYA)、谷氨酸合成酶1 (RrGLU1)和組蛋白樣轉(zhuǎn)錄因子(RrCBF/NF-Y)相互作用，Rro1G021400蛋白(RrF3H)直接與RrFDR和RrANR相互作用(圖6c)。上述結(jié)果表明，空心藨花青素的合成受RNA甲基化、結(jié)構(gòu)基因編碼蛋白和轉(zhuǎn)錄因子的相互作用調(diào)控。

研究總結(jié)

該研究獲得了一個(gè)高質(zhì)量的染色體水平基因組草圖，包含35.7%的重復(fù)序列和28067個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因。追蹤了薔薇科譜系特異性WGD事件，產(chǎn)生5090個(gè)目前可檢測(cè)的dgps，其中大多數(shù)進(jìn)行了純化選擇?？招乃懗墒旃麑?shí)花青素的積累主要是由芍藥苷-3-O-葡萄糖苷和芍藥苷-3-O-(6’’-O-丙二酰基)葡萄糖苷引起的。該研究發(fā)現(xiàn)了許多與花青素生物合成有關(guān)的結(jié)構(gòu)基因，它們的表達(dá)可能受到轉(zhuǎn)錄因子和結(jié)構(gòu)基因編碼的RNA甲基化和蛋白質(zhì)相互作用等遺傳機(jī)制的調(diào)控。研究結(jié)果可為空心藨及其他薔薇屬植物的定向馴化和育種提供參考。