2024年5月9日，韶關(guān)學(xué)院和華南農(nóng)業(yè)大學(xué)在國(guó)際學(xué)術(shù)期刊?Postharvest Biology and Technology?發(fā)表一項(xiàng)重要研究成果，題為：Metabolomics and transcriptomic profiles reveal membrane lipid metabolism being an important factor of sliced taro browning。該研究通過(guò)植物廣靶代謝組和轉(zhuǎn)錄組分析研究了芋頭片在冷藏過(guò)程中的褐變發(fā)展及潛在的褐變機(jī)制。這項(xiàng)研究有助于我們了解鮮切食品的褐變機(jī)制，為未來(lái)的研究和減輕冷藏條件下切片芋頭褐變的潛在策略提供寶貴的見(jiàn)解。
文章標(biāo)題：Metabolomics and transcriptomic profiles reveal membrane lipid metabolism being an important factor of sliced taro browning
期刊名稱：Postharvest Biology and Technology
影響因子：7.0
合作單位：韶關(guān)學(xué)院和華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
研究對(duì)象：芋頭
研究方法：生理、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)等
百邁客生物為該研究提供了植物廣靶、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和分析服務(wù)。
研究背景
在飲食中加入更多的新鮮蔬菜可以帶來(lái)許多健康益處，包括降低對(duì)慢性疾病的易感性和減緩衰老過(guò)程。市場(chǎng)上根莖類蔬菜切根產(chǎn)品的保質(zhì)期短，破壞了這些優(yōu)勢(shì)。切面褐變是限制切片蔬菜產(chǎn)品壽命的主要因素之一。因此，了解切片產(chǎn)品褐變背后的機(jī)制對(duì)于開(kāi)發(fā)創(chuàng)新技術(shù)至關(guān)重要，這些技術(shù)可以在儲(chǔ)存和消費(fèi)過(guò)程中有效地保持這些產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和整體質(zhì)量。
實(shí)驗(yàn)材料
本研究選用購(gòu)自中國(guó)韶關(guān)的“冰瑯玉”品種(Colocasia esculenta)。用于調(diào)查的芋頭大小相似，從大約800克到1000克不等，沒(méi)有任何明顯的缺陷或機(jī)械損傷。這些選定的芋頭被迅速運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室，為了確保清潔，在削皮和切割之前，要用自來(lái)水沖洗掉芋頭球莖表面殘留的淤泥。然后，將芋頭削皮，切成約1厘米厚的薄片作進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。首先用次氯酸鈉溶液(0.1 g/L)對(duì)芋頭切片進(jìn)行滅菌。隨后，將無(wú)菌芋頭片密封在聚乙烯袋中(0.02 mm厚，尺寸為20 × 30 cm) (Xiao et al, 2020)。最后，芋頭切片冷藏(4℃)， RH為90-95%，持續(xù)12天。樣品每隔2天采集一次，用于后續(xù)分析。在第0天(C0)、第6天(C6)和第12天(C12)獲得的樣本用于植物廣靶代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。
研究結(jié)果
1.生理分析——冷庫(kù)條件下芋頭片褐變?cè)u(píng)價(jià)
芋片切面顏色隨貯藏時(shí)間的變化如圖1A所示。切面L*值從0 d時(shí)的88.72下降到12 d時(shí)的80.36，冷藏12 d后L*值下降了9%(圖1A)。芋頭切片表面的a*、b*、△E和BI值在冷藏過(guò)程中也表現(xiàn)出類似的變化趨勢(shì)(圖1B-E)。這些褐變指標(biāo)隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。冷藏12 d后，a*、b*、△E和BI值分別比0 d增加了582%、58%、725%和19%(圖1B-E)。宏觀褐變癥狀在第6天首次出現(xiàn)，并在隨后的儲(chǔ)存過(guò)程中逐漸加劇(圖1F)。綜上所述，這些結(jié)果表明，即使在低溫(4℃)條件下，切片芋頭在儲(chǔ)存過(guò)程中也會(huì)發(fā)生褐變。
為了闡明切片芋頭褐變的機(jī)制，研究人員分別在第0天、第6天和第12天對(duì)芋頭樣品進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)分析。
圖1-4℃貯藏期間切片芋頭的褐變發(fā)展
2.代謝組分析——切片芋頭褐變過(guò)程代謝組學(xué)分析
為了比較芋頭切片褐變過(guò)程中三個(gè)階段代謝物組成的差異，研究通過(guò)植物廣靶代謝組學(xué)分析，總共成功鑒定了芋頭切片中的638種代謝物。PCA分析顯示，三個(gè)儲(chǔ)存點(diǎn)采集的芋頭樣品具有明顯的分離性(圖2A)。在C0 vs C6中，共鑒定出206個(gè)DAMs，其中99個(gè)DAMs的豐度增加，107個(gè)DAMs的豐度減少。C6 vs C12共197個(gè)DAMs，分別有84個(gè)DAMs豐度增加，113個(gè)DAMs豐度減少。C0 vs C12包括119個(gè)DAMs，分別有51個(gè)DAMs和68個(gè)DAMs顯示豐度增加和減少(圖2B)。這些結(jié)果表明，在褐變過(guò)程中，代謝物豐度的減少幅度更大。
韋恩圖分析評(píng)估每個(gè)差異分組特有和共有的DAMs (圖2C)。圖2D-F展示了每個(gè)比較組中豐度增加和減少的top20的DAMs。C6組中10個(gè)代謝物豐度升高，如2′-脫氧腺苷、3-O-對(duì)香豆?？鼘幩?、n -乙酰- l -蘇氨酸、松柏醛、9(10)-EpOME、6-O-咖啡酰丁醇、表肌醇、l -同型半胱氨酸、5-O-對(duì)香豆?？鼘幩?、異鼠李素。相反，琥珀酸酐、9-(阿拉伯糖基)次黃嘌呤、氨基丙酸、N6-(2-羥乙基)腺苷、2-(二甲氨基)鳥(niǎo)苷、芐基-(2 ‘-O-木糖基)葡萄糖苷、鳥(niǎo)苷、肌苷、D-甘露糖和肌苷5 ‘ -單磷酸在C6組中的豐度較低(圖2D)。
在C6和C12中，9(10)- epOME、n -乙酰- l-蘇氨酸、2 ‘ -脫氧腺苷、松木醛、2-亞麻油基甘油-1,3-二- O-葡萄糖苷、6- O -對(duì)咖啡?；芄?、5-O-對(duì)香豆?；鼘幩?、異鼠李素、反式- 4-羥基肉桂酸甲酯和3- O -對(duì)香豆酰基奎寧酸在C12組中表現(xiàn)出更高的富集度。相反，9-(阿拉伯糖基)次黃嘌呤、酪氨酸、S-Aiiyl-L-半胱氨酸、8，11，14-二十烷三烯酸甲酯、L-蛋氨酸甲酯、LysoPC17:0、鳥(niǎo)苷、肉桂酸、11、14、17-二十碳三烯酸和黃嘌呤在C6組中具有更高的豐度(圖2E)。
在C0和C12中，9(10)- epOME、n -乙酰- L-蘇氨酸、2 ‘ -脫氧腺苷、5- O -對(duì)香豆酰基奎寧酸、2-亞麻油基甘油-1,3-二- O -糖苷、松木醛、6- O -對(duì)咖啡酰基熊果甙、異鼠李素、3-O-對(duì)香豆?；鼘幩岷头词?4-羥基肉桂酸甲酯在C12組中含量較高。相反，9-(阿拉伯糖基)次黃嘌呤、肌苷、S – aiiyl -L -半胱氨酸、8，11，14-二十烷三烯酸甲酯、L-蛋氨酸甲酯、LysoPC17:0、鳥(niǎo)苷、肉桂酸、11、14、17-二十碳三烯酸和黃嘌呤在C0組中表現(xiàn)出更高的豐度(圖2F)。
圖2-切片芋頭植物廣靶代謝組分析
3.代謝組分析——切片芋頭褐變過(guò)程中DAMs的積累模式
為進(jìn)一步分析代謝物在9個(gè)樣本的積累模式，該研究進(jìn)行了聚類熱圖分析。結(jié)果顯示，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，褐變程度逐漸增加，推測(cè)持續(xù)增加的DAMs可能有助于切片芋頭的褐變或促進(jìn)其褐變過(guò)程。因此，該研究關(guān)注分析在褐變過(guò)程中豐度持續(xù)上升的DAMs (圖3B-L)。確定了11個(gè)DAMs在褐變過(guò)程中豐度持續(xù)增加，如2-α-亞麻烯酰甘油、甘油亞油酸、(9Z,11E)-十八烯二烯酸、N-油基乙醇胺、γ-亞麻酸、1-亞麻油基甘油、2-亞麻油基甘油、N-α-乙?；? L-鳥(niǎo)氨酸、α-亞麻酸、9-羥基-10、12-十八烯二烯酸和1-α-亞麻烯酰甘油。值得注意的是，在這11個(gè)DAMs中，有10個(gè)是脂肪酸或脂質(zhì)衍生物。幾種褐變指標(biāo)與這些水DAMs之間的相關(guān)系數(shù)非常高。這些結(jié)果表明，在切片芋頭中脂質(zhì)代謝與褐變發(fā)展之間存在潛在的聯(lián)系。
圖3-切片芋頭中差異代謝物(DAMs)的積累模式
4.轉(zhuǎn)錄組分析——冷藏芋頭切片褐變過(guò)程的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析
為了更好地了解基因表達(dá)的變化，該研究進(jìn)行比較轉(zhuǎn)錄組分析。結(jié)果顯示許多基因在芋褐變過(guò)程中表現(xiàn)出不同的表達(dá)譜。具體來(lái)說(shuō)，在C0和C6的比較中，鑒定出3103個(gè)表達(dá)上調(diào)的基因和1685個(gè)表達(dá)下調(diào)的基因。同樣，在C6和C12組的比較中，發(fā)現(xiàn)3021個(gè)DEGs上調(diào)，2350個(gè)DEGs下調(diào)。此外，與C0組相比，C12組有5108個(gè)基因的表達(dá)量更高(圖4A)。在褐變過(guò)程中發(fā)現(xiàn)了更多的上調(diào)基因，表明芋頭的基因表達(dá)發(fā)生顯著的變化。有趣的是，當(dāng)比較C0與C6、C6與C12、C0與C12之間的DEGs時(shí)，發(fā)現(xiàn)1396個(gè)DEGs重疊(圖4B)。
根據(jù)褐變過(guò)程中的表達(dá)模式，將DEGs分為6個(gè)簇。每個(gè)聚類(從1到6)分別由1607、1293、533、1741、634和2470個(gè)度組成(圖4C)。KEGG富集分析顯示，簇1中有四個(gè)途徑的DEGs顯著富集:α-亞麻酸代謝、生物素代謝、植物-病原體相互作用以及淀粉和蔗糖代謝(圖4D)。此外，集群2中的DEGs在α-亞麻酸代謝、植物-病原體相互作用以及倍半萜和三萜生物合成途徑中富集(圖4E)。
圖4-切片芋頭褐變過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析
5.聯(lián)合分析——基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建
為了進(jìn)一步研究脂質(zhì)代謝與冷藏芋頭切片褐變之間的關(guān)系，研究采用WGCNA分析進(jìn)行研究。如圖5A所示，鑒定出兩個(gè)與切片芋頭在冷藏期間褐變發(fā)育顯著相關(guān)的模塊。藍(lán)色模塊中基因與褐變BI、a*、b*、△E 4項(xiàng)指標(biāo)呈正相關(guān)，而綠松石模塊中基因與褐變指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)(圖5B)。此外，隨著褐變的發(fā)展，藍(lán)色模塊中基因的表達(dá)量逐漸增加，而綠松石模塊中基因的表達(dá)量逐漸減少(圖5C)。此外，藍(lán)色和綠松石模塊中每個(gè)基因與褐變的相關(guān)性都很高(圖5D)，說(shuō)明這兩個(gè)模塊的基因與冷藏芋頭片的褐變發(fā)育高度相關(guān)。
切片芋頭的褐變與藍(lán)色模塊中的基因正相關(guān)，對(duì)該模塊中的基因進(jìn)行了KEGG富集分析。在top20個(gè)富集的KEGG通路中，泛素介導(dǎo)的蛋白水解、α-亞麻酸代謝和谷胱甘肽代謝是富集最顯著的通路。尤其是α-亞麻酸代謝途徑和甘油脂代謝途徑中分別富集了14個(gè)和18個(gè)基因(圖5E)。這些結(jié)果為脂質(zhì)代謝參與切片芋頭褐變的事實(shí)提供了進(jìn)一步的線索。
圖5-WGCNA對(duì)模塊與性狀的相關(guān)性分析
6.基因驗(yàn)證——參與亞麻酸代謝的DEGs的表達(dá)模式
為了驗(yàn)證RNA-seq數(shù)據(jù)的質(zhì)量，研究檢測(cè)了亞麻酸代謝途徑中DEGs的表達(dá)模式。在切片芋頭褐變過(guò)程中，該途徑中的DEGs差異表達(dá)(圖6A)。在這些基因中，4個(gè)基因(taro_028466、029177、001379和new gene_1582)的表達(dá)量在第6天較0天下降(圖6A)。10個(gè)基因(taro_026230、017933、007794、026197、032526、040173、011856、050352以及new gene_27424和3563)的表達(dá)量在第6天出現(xiàn)了增加，隨后又出現(xiàn)了下降。然而，這些基因在第12天的表達(dá)水平仍然高于第0天(圖6A)。其余15個(gè)基因在褐變過(guò)程中表現(xiàn)出穩(wěn)定的表達(dá)增加。這些結(jié)果再次證實(shí)了亞麻酸代謝參與了芋頭褐變過(guò)程。
作者選擇了5個(gè)DEGs進(jìn)行qRT-PCR分析(圖6B-F)。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)或褐變程度的惡化，這5個(gè)基因的表達(dá)量均呈上升趨勢(shì)。此外，通過(guò)RNA-seq和qRT-PCR分析確定的這些基因的總體表達(dá)模式高度一致(圖6B-F)，證實(shí)了轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)的可靠性。
圖6-亞麻酸代謝途徑中DEGs的表達(dá)模式
7.基因驗(yàn)證——在褐變過(guò)程中，膜脂過(guò)氧化作用加劇
上述結(jié)果表明，膜脂代謝可能在芋頭褐變過(guò)程中起一定作用。為了進(jìn)一步研究，評(píng)估了參與膜脂過(guò)氧化的關(guān)鍵DEGs的表達(dá)譜，如脂肪酶(LIP)和脂氧合酶(LOX)。三個(gè)差異表達(dá)的LIP基因在褐變過(guò)程中表達(dá)持續(xù)增加。LOX基因，除了8個(gè)LOX基因在褐變過(guò)程中逐漸增加，其他基因在褐變過(guò)程中表達(dá)先增加后下降 (圖7a)。這些結(jié)果表明，新鮮切割操作(如剝皮和切割)激活了芋頭的脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程。
丙二醛通常被認(rèn)為是植物脂質(zhì)過(guò)氧化的生物標(biāo)志物。為了監(jiān)測(cè)切片芋頭褐變過(guò)程中膜脂過(guò)氧化情況，測(cè)定了LOX活性和MDA含量。隨著時(shí)間的推移，LOX活性和MDA含量隨著褐變繼續(xù)進(jìn)行逐漸升高 (圖7B, C)。這些結(jié)果表明，在褐變過(guò)程中，膜脂過(guò)氧化加劇。此外，相關(guān)分析顯示，LOX活性、MDA含量和其他褐變指標(biāo)之間存在很強(qiáng)的相關(guān)性?(圖7D)。這些結(jié)果進(jìn)一步支持了膜脂過(guò)氧化和/或代謝參與芋頭褐變。
圖7-膜脂過(guò)氧化的評(píng)價(jià)
研究總結(jié)
切面褐變的發(fā)生是鮮切行業(yè)中切片芋頭生產(chǎn)和商業(yè)化的一個(gè)重要障礙。代謝組學(xué)分析顯示，在芋頭褐變過(guò)程中，亞麻酸及其衍生物以及氫過(guò)氧化物的含量增加，表明發(fā)生了膜脂降解。RNA-seq分析顯示，參與褐變過(guò)程的DEGs富集于α-亞麻酸代謝途徑。WGCNA分析得到了兩個(gè)與芋頭褐變密切相關(guān)的模塊，其中藍(lán)色模塊的基因與BI呈正相關(guān)，強(qiáng)化了膜脂代謝與芋頭褐變之間的聯(lián)系。隨著芋頭褐變的進(jìn)行，LOX基因的表達(dá)和蛋白活性以及MDA的水平增加，表明膜脂過(guò)氧化促進(jìn)了切片芋頭褐變?？傊撗芯拷Y(jié)果強(qiáng)調(diào)了膜脂代謝在切片芋頭褐變中的重要性。這項(xiàng)研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組和植物廣靶代謝組分析全面研究了芋頭褐變的機(jī)制。
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