空間組學技術正在廣泛應用腫瘤微環(huán)境分析，高通量高分辨率空間轉(zhuǎn)錄組技術如何在單細胞分辨率維度剖析腫瘤細胞與免疫細胞在空間位置上真實互作？今天小編給大家?guī)肀本┐髮W第一醫(yī)院的張寧、李航及北京大學-云南白藥國際醫(yī)學中心薛瑞棟團隊合作于2024年5月在Cancer Cell在線發(fā)表題為《Integrative molecular and spatial analysis reveals evolutionary dynamics and tumor-immune interplay of?in situ?and invasive acral melanoma》的研究論文，利用多組學技術解析原位肢端型黑色素瘤到侵襲性腫瘤的克隆演變規(guī)律，并高精度揭示了APOE+/CD163+巨噬細胞的空間富集狀態(tài)和EMT腫瘤細胞的互作，發(fā)現(xiàn)APOE和CD163可用于預測iAM的預后，為肢端型黑色素瘤的早期診斷和臨床診療提供了重要依據(jù)。
文章標題：Integrative molecular and spatial analysis reveals evolutionary dynamics and tumor-immune interplay of?in situ?and invasive acral melanoma
期刊名稱：Cancer Cell
影響因子：50.3
合作單位：北京大學第一醫(yī)院、北京大學-云南白藥國際醫(yī)學研究中心
研究方法：全外顯子組、基于顯微切割的多區(qū)域全外顯子測序、bulk轉(zhuǎn)錄組、單細胞轉(zhuǎn)錄組、空間轉(zhuǎn)錄組和CODEX空間蛋白組學
百邁客生物為該研究提供了BMKMANU S1000空間轉(zhuǎn)錄組細胞分割技術服務。
研究背景
肢端型黑色素瘤（acral melanoma, AM）是一種起源于手掌、足底和甲下等部位的惡性皮膚腫瘤，也是亞洲人群中最主要的黑色素瘤亞型，常發(fā)生轉(zhuǎn)移且預后不佳。原位AM（AM in situ, AMis）經(jīng)手術切除后極少復發(fā)，但侵襲性AM（invasive AM, iAM）的預后不佳，且PD-1單抗治療響應率僅約20%-30%，缺乏有效的治療策略。因此，AMis突破基底膜進入真皮發(fā)展為iAM是造成患者預后變差的重要里程碑事件。然而，目前關于AMis的研究仍然十分有限，AMis向iAM的演化過程尚不清楚，免疫微環(huán)境在這一過程中發(fā)揮的作用也不明確。AM的早期發(fā)現(xiàn)和預防可以顯著提高病人預后和治療。
材料方法
研究材料：
287例肢端型黑色素瘤（AM）患者，146例原位AM（AMis）和141例侵襲性AM（iAM），其中測序隊列（147例，其中56例AMis和91例iAM）和驗證隊列（140例，驗證所鑒定出的標志物和臨床相關性）。
驗證實驗：流式分選巨噬細胞（AM患者腫瘤組織和配對外周血，n=4）；健康供體外周血單核細胞和 LM-MEL-45腫瘤細胞系C.M.共培養(yǎng)（0、3、5、7、10、14天，n=3）；流式分選C3患者和非C3患者EMT腫瘤細胞（n=4）；APOE+/CD163+巨噬細胞和腫瘤細胞共培養(yǎng)體系（n=3）；LM-MEL-45腫瘤細胞系：野生型和IGF1R KO，IGF1抑制劑處理（xentuzumab），IGF1R抑制劑處理（linsitinib）
研究方法：
全外顯子組測序（n=92）、基于顯微切割的多區(qū)域全外顯子測序（n=33）、bulk轉(zhuǎn)錄組（n=81）、單細胞轉(zhuǎn)錄組（scRNA-seq，n=24）、空間轉(zhuǎn)錄組（BMKMANU S1000，n=10）空間蛋白組學（CODEX，n=12）。
研究結果
1.研究隊列信息和基因組圖譜
為了探究肢端型黑色素瘤的演化規(guī)律及免疫微環(huán)境在其中的作用，研究人員建立了一個287例患者的隊列，包含146例AMis和141例iAM，為研究AMis到iAM的演化過程提供了豐富的資源。研究人員將所有患者分為測序隊列（147例）和驗證隊列（140例），測序隊列包括56個AMis患者和91個iAM患者。
對測序隊列進行了多組學測序，包括全外顯子組、基于顯微切割的多區(qū)域全外顯子測序、bulk轉(zhuǎn)錄組、單細胞轉(zhuǎn)錄組、空間轉(zhuǎn)錄組和CODEX空間蛋白組學，而驗證隊列用于驗證所鑒定出的標志物的臨床相關性。
全外顯子組測序平均覆蓋度為313X，基因組圖譜顯示本研究隊列的腫瘤突變負荷（TMB）與以前的AM研究相比較，高于UM組，低于CM組。本研究數(shù)據(jù)驗證了之前報道22q11.21擴增與AM預后相關，說明了本研究隊列的高質(zhì)量，能夠?qū)M侵襲進行深入分析。
圖1-研究策略和隊列信息
2.AMis和iAM的基因組比較確定了侵襲驅(qū)動因素
為了確定AM垂直侵襲的驅(qū)動機制，研究人員首先描繪了AMis和iAM的基因組圖譜，并系統(tǒng)比較了兩者的點突變、拷貝數(shù)變異、突變負荷、突變印記、亞克隆突變及基因組不穩(wěn)定性。分析結果表明iAM的亞克隆突變比例和基因組不穩(wěn)定性顯著升高。這種高度的基因組不穩(wěn)定性可能會加速腫瘤的發(fā)生并有助于獲得侵襲驅(qū)動突變。
值得注意的是，研究人員發(fā)現(xiàn)驅(qū)動突變（NRAS, KRAS, NF1, KIT）在iAM中顯著富集，并在體外實驗中驗證了這些驅(qū)動突變可以增強肢端型黑色素瘤的侵襲能力。這些結果表明AM侵襲高度依賴于獲得某些驅(qū)動突變，而不是簡單地積累更多的突變。
AMis和iAM的轉(zhuǎn)錄組學比較顯示在iAM中富集細胞外基質(zhì)(ECM)組織、EMT、KRAS、巨噬細胞遷移和干擾素γ (IFNγ)?通路，暗示AM侵襲期間TME失調(diào)。總的來說，驅(qū)動突變、基因組不穩(wěn)定性和TME改變共同作用有助于AM侵襲。另外，研究人員還發(fā)現(xiàn)附屬器受累也與AMis的驅(qū)動突變及侵襲能力密切相關。
圖2-AMis和iAM的基因組比較
3.早期AM的演化克隆過程
本文利用LCM技術探討患者內(nèi)部垂直侵襲和區(qū)域擴張的進化動態(tài)。首先比較了AMis、Syn_AMis和Syn_iAM三種不同類型病變的基因組圖譜，在5例表現(xiàn)出侵襲驅(qū)動基因的患者中發(fā)現(xiàn)配對的Syn-AMis和Syn-iAM共有突變，但是在純AMis中沒有檢測到。這個結果表明在垂直侵襲之前就已經(jīng)獲得了侵襲驅(qū)動突變，進一步證實了它們在AM侵襲中的驅(qū)動作用，這些結果也證實之前提到的基因組不穩(wěn)定性有助于AM侵襲。進一步探索垂直侵襲起源，研究結果表明，在垂直侵襲階段，AMis在演化早期獲得驅(qū)動突變并迅速穿過基底膜，以單克隆播散到真皮中。
為了探究區(qū)域擴張的演化模式，通過腫瘤細胞分數(shù)?(CCF)推測其克隆組成分析發(fā)現(xiàn)不同患者中存在兩種不同的擴張模式：（1）CE，克隆擴張，即腫瘤細胞保持單一克隆結構進行均質(zhì)擴張；（2）SD，亞克隆分化，即腫瘤細胞在增殖過程中獲得亞克隆，導致腫瘤異質(zhì)性升高。
圖3-AM侵襲的進化動力學
4.多組學分析確定AM三種分子亞型
為了進一步了解AM分子亞型，本文利用bulk RNA-seq對81名患者進行檢測，確定C1、C2、C3三種分子亞型。C1亞型作為“角蛋白”亞型，C2亞型提示“染色質(zhì)重塑”表型，C3亞型表現(xiàn)出“增殖”表型。C3亞型亞克隆突變比例最高，且預后最差。其中C1和C2是均勻混合AMis和iAM，C3亞型高度富集iAM，表明iAM是一個獨特的子集。與非C3 iAM（C1和C2 iAM）相比較，C3 iAM表現(xiàn)為PFS縮短和明顯的惡性現(xiàn)象類型，尤其值得注意的是C3 iAM表現(xiàn)出顯著性更多的亞克隆突變。同時發(fā)現(xiàn)C3亞型表現(xiàn)出較高水平的免疫浸潤、腫瘤相關巨噬細胞(TAM)和EMT，而通過這三種AM分子亞型來看腫瘤負荷與TAM評分是相互獨立的。相比之下，TAM評分與基因組不穩(wěn)定性相關，包括wGII和CNH-DNA評分以及亞克隆突變。此外, TAM評分與EMT評分相關和預后差。這些結果共同表明TAM的浸潤可能會促進C3的腫瘤EMT和基因組不穩(wěn)定性并導致預后不良。
圖4-AM的分子亞型和TME
5.scRNA-seq鑒定APOE+/CD163+巨噬細胞亞群
為了在單細胞水平研究腫瘤和TME細胞異質(zhì)性，利用單細胞轉(zhuǎn)錄組技術對8個AMis?和16個iAM進行檢測，一共獲得223023個細胞，聚類分為13個細胞群。并針對巨噬細胞進行亞群分析，鑒定5種亞群，包括Mph_APOE_CD163，Mph_APOE, Mph_CD163， Mph_ISG15，和Mph_TIMP1。分析顯示Mph_APOE_CD163、Mph_CD163和Mph_APOE 均為免疫抑制TAM，因此統(tǒng)稱為?APOE+/CD163+ TAM。研究發(fā)現(xiàn)這類巨噬細胞在C3亞型中顯著富集，且浸潤程度與腫瘤EMT分數(shù)正相關。配體-受體分析表明，巨噬細胞表現(xiàn)出最豐富的細胞間相互作用。
圖5-單細胞分辨率AM腫瘤微環(huán)境動態(tài)
6.空間轉(zhuǎn)錄組學分析證實了APOE+/CD163+ TAM與EMT腫瘤細胞之間的直接接觸和密切相互作用
為了探索APOE+/CD163+ TAM與EMT高水平的腫瘤細胞相關作用，通過空間轉(zhuǎn)錄組測序技術（ST，BMKMANU S1000）檢測10個AM樣品。結果可清晰觀察到腫瘤組織多層結構，包括表皮層：基層、棘層和顆粒層、以及分泌汗腺的皮下結構和血管。在C3 iAM患者中，腫瘤區(qū)域富集大量的EMT高水平的腫瘤細胞，同時也高度浸潤了APOE+/CD163+ TAM，而在非C3患者中無法發(fā)現(xiàn)這種共存。正如預期的那樣，C3患者表現(xiàn)出EMT腫瘤細胞比例明顯較高，并且APOE+/CD163+ TAM水平增高。C3患者中，在空間位置上APOE+/CD163+ TAM更接近EMT腫瘤細胞。CellChat分析顯示APOE+/CD163+ TAM作為信號發(fā)送者(配體)和接收著（受體）均表現(xiàn)出高活性，證實了其具有細胞與細胞強互作。與其他免疫細胞相比，APOE+/CD163+ TAM表現(xiàn)出最高水平的胰島素生長因子(IGF)信號網(wǎng)絡的發(fā)送細胞和接收細胞，這些結果揭示APOE+/CD163+ TAM和EMT腫瘤細胞在空間上的直接接觸和密切相互作用。
圖6-APOE+/CD163+巨噬細胞與EMT腫瘤細胞的空間互作關系
文中如何在空間上實現(xiàn)單細胞分辨率EMT腫瘤細胞和非EMT腫瘤細胞的詳細注釋呢？
研究者利用高分辨空間轉(zhuǎn)錄組技術結合細胞分割方法定位到腫瘤EMT狀態(tài)的細胞被定義為EMT腫瘤細胞，而非EMT腫瘤細胞被映射到其他腫瘤狀態(tài)。
圖7-空間轉(zhuǎn)錄組細胞分割和空間蛋白組鑒定APOE+/CD163+ TAM與EMT腫瘤細胞共定位 A 細胞分割：紅色：APOE+/CD163+巨噬細胞 ；藍色：EMT腫瘤細胞；灰色：其他腫瘤細胞 B 細胞分割：紅色：APOE+/CD163+巨噬細胞；橙色：EMT腫瘤細胞；藍色：其他腫瘤細胞；灰色：其他細胞。
7.多重空間蛋白質(zhì)組學驗證了APOE+/CD163+ TAM與EMT腫瘤細胞之間的相互作用
進一步驗證APOE+/CD163+?TAM和EMT腫瘤細胞在蛋白水平上的空間分布和相互作用，文中對12個AM樣本進行了空間蛋白組檢測（22 plex CODEX）。其中C3患者以EMT腫瘤區(qū)域為主，非C3患者以非EMT腫瘤區(qū)域為主，結果表明APOE+/CD163+ TAM與EMT腫瘤細胞呈正相關。在C3患者中，IGF1和IGF1R的表達水平均顯著升高。APOE+/CD163+ TAM高度富集在EMThigh區(qū)域。同時IGF1和IGF1R在EMThigh區(qū)域也顯著升高。這些結果在單細胞水平和空間水平均支持APOE+/CD163+?TAM可能通過IGF1-IGF1R相互作用促進腫瘤細胞的EMT。
圖8-空間蛋白組證實圖APOE+/CD163+巨噬細胞與EMT腫瘤細胞的空間互作
8.實驗驗證APOE+/CD163+ TAM通過IGF1-IGF1R相互作用促進腫瘤細胞的EMT
流式分選患者腫瘤組織和配對外周血APOE+/CD163+ TAM，蛋白水平可以檢測到APOE+/CD163+ TAM的表達，同時AM細胞可以誘導APOE+/CD163+ TAM表型。離體分析證實C3患者的EMT腫瘤細胞的比例明顯高于非C3患者，ELISA分析顯示，與APOE+/CD163+ TAM共培養(yǎng)后，IGF1蛋白的分泌持續(xù)升高，而IGF1抑制劑、IGF1R抑制劑及敲除腫瘤的IGF1R均可以抑制這一過程，這些結果表明APOE+/CD163+ TAM可以通過IGF1-IGF1R相互作用促進腫瘤細胞的EMT。研究人員還在兩個獨立隊列中驗證了APOE和CD163染色可用于預測AM的預后。
圖9-實驗驗證APOE+/CD163+巨噬細胞與腫瘤細胞的互作關系及預后潛能
研究總結
綜上所述，本研究基于多組學測序，系統(tǒng)揭示了早期肢端型黑色素瘤的克隆演化規(guī)律，建立了肢端型黑色素瘤的分子分型，解析了腫瘤細胞-免疫細胞的空間互作關系，鑒定出新的早期診斷標志物（驅(qū)動突變和附屬器受累）及晚期預后標志物（APOE和CD163），為肢端型黑色素瘤的早期診斷和精準診療提供了重要信息。
北京大學第一醫(yī)院的張寧教授、李航教授和北京大學-云南白藥國際醫(yī)學研究中心的薛瑞棟研究員（北京大學第一醫(yī)院兼職教授）為共同通訊作者。北京大學-云南白藥國際醫(yī)學研究中心劉恒康博士后、北京大學第一醫(yī)院皮膚性病科高嘉雯博士和北京大學第一醫(yī)院腫瘤轉(zhuǎn)化研究中心馮梅博士后為共同第一作者。
參考文獻：
Liu et al., Integrative molecular and spatial analysis reveals evolutionary dynamics and tumor-immune interplay of?in situ?and invasive acral melanoma,?Cancer Cell?(2024), https://doi.org/10.1016/j.ccell.2024.04.012
百創(chuàng)S3000?3.5μm?極致提升空間檢測深度和精度
基于空間組學快速發(fā)展，百邁客自主創(chuàng)新單細胞分辨率空間轉(zhuǎn)錄組技術（S1000、S2000、S3000），開創(chuàng)原片無錯高清H&E+原片無錯熒光+原片測序，“三片合一”實現(xiàn)精準的細胞分割，將空間轉(zhuǎn)錄組推進到真實單細胞分辨率的領域。
經(jīng)過不斷打磨，百創(chuàng)智造于2024年3月27日在山東青島正式發(fā)布了百創(chuàng)S3000空間轉(zhuǎn)錄組芯片，性能全面升級，極致提升空間組學檢測的深度和精度。
百創(chuàng)S3000在6.8mm*6.8mm 的捕獲區(qū)域內(nèi)鋪設了4,144,770個捕獲位點，相鄰兩個捕獲位點的中心距為3.5μm。
相較于現(xiàn)在廣受市場認可與好評的百創(chuàng)S1000轉(zhuǎn)錄組芯片，捕獲位點數(shù)提升近2倍，分辨率同樣提升近2倍。
在相同的測序飽和度下，單細胞級別分辨率下中位UMI提升了30%~70%，中位基因數(shù)提升30%-60%。
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