植物磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)新技術(shù)！—GreenPhos【IF21.949】

期刊名稱：Molecular Plant

影響因子：21.949

發(fā)表單位：中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所

研究部位：高等植物及綠色生物

研究方法：磷酸化蛋白質(zhì)組、PRM靶向蛋白組

研究背景

2023年11月27日，中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所汪迎春團(tuán)隊(duì)在Molecular Plant在線發(fā)表了題為GreenPhos, a universal method for in-depth measurement of plant phosphoproteomes with high quantitative reproducibility?的研究論文。論文中報(bào)道了一種具有突破性的植物磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)新技術(shù)。該技術(shù)采用了簡(jiǎn)化、穩(wěn)健的工作流程，有效地克服了植物磷酸化蛋白質(zhì)組分析的主要技術(shù)難點(diǎn)，能高靈敏度、高特異性快速地富集植物磷酸肽。利用該技術(shù)可定量分析不同植物的磷酸蛋白質(zhì)組，其分析深度之深、定量重復(fù)性之高前所未有，有望成為植物磷酸蛋白組學(xué)的通用技術(shù)。由于該技術(shù)主要面向高等植物及其它綠色生物（如衣藻），且操作簡(jiǎn)便，極大地降低了實(shí)驗(yàn)所需的人力和試劑費(fèi)用，因此命名為GreenPhos (綠磷)。

蛋白質(zhì)磷酸化在植物的生長(zhǎng)、發(fā)育、環(huán)境適應(yīng)以及作物的產(chǎn)量和品質(zhì)調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用。深度解析磷酸化蛋白質(zhì)組是全面理解磷酸化如何行使功能的有效手段。然而，與動(dòng)物相比，植物磷酸化蛋白質(zhì)組的深度解析在技術(shù)上更具挑戰(zhàn)性。因?yàn)橹参锛?xì)胞具有致密的細(xì)胞壁和大量的包括色素在內(nèi)的次生代謝物，前者極大地增加了蛋白質(zhì)提取的難度，而后者嚴(yán)重地干擾了磷酸肽富集的效率和特異性。

實(shí)驗(yàn)材料

野生型擬南芥(Col-0)幼苗在10%漂白劑中表面消毒，在無(wú)菌去離子水中漂洗，然后播種在含有1%瓊脂，pH為5.8的半強(qiáng)度Murashige和Skoog (1/2 MS)培養(yǎng)基上。種子在4℃的黑暗條件下發(fā)芽2天。幼苗在1/2 MS固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)10天，然后轉(zhuǎn)移到1/2 MS液體培養(yǎng)基上，再培養(yǎng)16小時(shí)。在鹽脅迫實(shí)驗(yàn)中，將幼苗轉(zhuǎn)移到添加或不添加(對(duì)照) 100mM NaCl的新鮮培養(yǎng)基中，根據(jù)需要孵育30 min或120 min。

研究結(jié)果

1.GreenPhos的開(kāi)發(fā)——一種穩(wěn)定高效的純化植物磷酸肽的方法

從植物組織中高效提取蛋白質(zhì)是深入分析植物蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組的第一步和關(guān)鍵一步。為此，作者比較了SDS、GdnHCl和SDC等不同變性劑對(duì)擬南芥葉片中蛋白質(zhì)的提取性能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SDS-和SDC-提取的蛋白的性能相似，但優(yōu)于GdnHCl。植物樣品相較于動(dòng)物樣品含有較低濃度的蛋白質(zhì)，因此作者優(yōu)化了磷酸化蛋白質(zhì)組的提取和富集的方法，即用SDS或GdnHCl緩沖液提取的蛋白質(zhì)樣品，在蛋白質(zhì)消化和隨后的磷酸肽富集之前，必須去除變性劑(圖1A)。接著用氯仿-甲醇沉淀提取的樣品，去除變性劑和其他干擾生物分子(圖1A和1B)。而作者通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SDC法提取的蛋白樣本不需要經(jīng)過(guò)氯仿-甲醇沉淀，而鑒定到的磷酸化蛋白更多，同時(shí)需要的植物材料更少。因此作者認(rèn)為SDC法更節(jié)省成本達(dá)到更好的效果，并在番茄、水稻、綠藻等生物中得到驗(yàn)證，從而確定了磷酸化蛋白組學(xué)的方法，稱之為GreenPhos。

2.?GreenPhos與當(dāng)前磷酸肽富集方法的比較

GreenPhos與當(dāng)前基于polyMAC的磷酸肽制備方法相比，在上機(jī)蛋白等量的情況下，GreenPhos方法平均鑒定出11072個(gè)磷酸化位點(diǎn)，而polymac法鑒定出9399個(gè)磷酸化位點(diǎn) (圖2B)，表明GreenPhos的分析深度比PolyMAC的高18%，并且需要的樣本量更少，省去了更多的實(shí)驗(yàn)步驟和時(shí)間。與此同時(shí)，作者發(fā)現(xiàn)GreenPhos的富集選擇性(92%)也高于PolyMAC的富集選擇性(54%)（圖2C）?？赡茉蚴谴紊x物的存在影響了磷酸肽對(duì)TiO2珠的親和力，PolyMAC優(yōu)先富集磷酸化肽，而GreenPhos富集了更多的雙重或多重磷酸化肽(圖2D-E)?？傊?，在當(dāng)前實(shí)驗(yàn)條件下，GreenPhos優(yōu)于基于polyMAC的方法。

3.GreenPhos的靈敏度和定量性能

為了進(jìn)一步測(cè)試GreenPhos的效率和靈敏度，作者從擬南芥葉片中提取蛋白質(zhì)(100、300、600和900μg)，分別從4個(gè)樣品中分別富集磷酸肽，并通過(guò)LC-MS分析（圖3A）。通過(guò)比較鑒定出的磷位點(diǎn)和磷酸肽的數(shù)量，發(fā)現(xiàn)兩者都隨著上機(jī)量的增加而增加，達(dá)到600μg后鑒定出的磷酸化位點(diǎn)和磷酸化肽的小幅增加 (圖3A和3B)。說(shuō)明鑒定的磷酸化位點(diǎn)的數(shù)量與起始蛋白的數(shù)量不存在正相關(guān)，因?yàn)長(zhǎng)C-MS在使用相同的獲取參數(shù)時(shí)是飽和的。

為了評(píng)估GreenPhos在定量磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)中的潛力，作者了鑒定的磷酸化肽與上機(jī)量之間的定量關(guān)系。以900μg為參照，在100、300和600μg中，檢測(cè)到的磷酸肽強(qiáng)度比與參考中磷酸肽強(qiáng)度比的中位數(shù)與理論值具有很好的相關(guān)性(圖3C)。分析結(jié)果表明，GreenPhos與單次LC-MS結(jié)合可用于從高達(dá)600μg的蛋白質(zhì)中定量磷酸肽，準(zhǔn)確度高。通過(guò)5次重復(fù)質(zhì)譜分析，評(píng)價(jià)了GreenPhos在植物磷蛋白組定量鑒定中的再現(xiàn)性。5個(gè)生物重復(fù)和5個(gè)技術(shù)重復(fù)的磷酸肽強(qiáng)度的Pearson相關(guān)系數(shù)平均分別為0.95和0.97 (圖3D和3E)，表明具有較高的定量可重復(fù)性。從5個(gè)生物重復(fù)中共鑒定出磷酸化位點(diǎn)14063個(gè)，其中74%的磷酸化位點(diǎn)至少在2個(gè)重復(fù)中鑒定出 (圖3F)。結(jié)果表明，GreenPhos可以在定量和定性上產(chǎn)生高度可重復(fù)性的結(jié)果。

4.?利用GreenPhos對(duì)擬南芥鹽脅迫誘導(dǎo)的磷酸化蛋白組分析

為了深入了解擬南芥對(duì)鹽脅迫響應(yīng)中蛋白磷酸化介導(dǎo)的信號(hào)，作者使用GreenPhos和單次LC-MS檢測(cè)，分析了100 mM NaCl處理30分鐘(T30)和120分鐘(T120)或未處理(T0)的擬南芥幼苗的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)(圖4A)。每個(gè)處理包括3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)600μg蛋白用于磷酸肽的富集?？偣矎?316個(gè)磷酸化蛋白中鑒定出12908個(gè)磷酸肽，含有15889個(gè)磷酸化位點(diǎn)。在磷酸肽中，13473個(gè)磷酸位點(diǎn)在處理的至少一個(gè)重復(fù)中包含可量化的信息。

對(duì)三個(gè)重復(fù)中至少任意兩個(gè)重復(fù)中的11128個(gè)磷酸位點(diǎn)進(jìn)行了label free定量。采用p< 0.05篩選不同處理間存在差異的磷酸化位點(diǎn)。聚類分析顯示，磷酸化蛋白形成了四個(gè)不同的簇，顯示了鹽脅迫誘導(dǎo)的磷酸化水平在所有處理中表現(xiàn)出顯著差異(圖4B)。在簇1中，磷酸化水平在鹽脅迫30 min后適度下降，在120 min后升高。在簇2中，磷酸化水平在30 min時(shí)總體上升，而在120 min后維持在相似的水平。在簇3中，磷酸化水平在30 min時(shí)沒(méi)有顯著變化，在120 min時(shí)下降。在簇4中，磷酸化水平在30 min鹽脅迫下下降，并在120 min時(shí)維持在類似的水平。

使用Fisher’s-exact對(duì)每個(gè)簇中的磷酸化蛋白進(jìn)行GO和KEGG富集分析(圖5)。與報(bào)道一致，在細(xì)胞組分條目，細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜蛋白在所有簇中被顯著富集。在分子功能條目，激酶活性在簇1、2和4中富集，而在簇3中不富集，但是蛋白質(zhì)去磷酸化的在生物過(guò)程條目在簇3中富集。結(jié)果表明，激酶的磷酸化激活和磷酸酶的去磷酸化是鹽脅迫誘導(dǎo)的重要反應(yīng)。

5.?磷酸化motif分析顯示鹽脅迫誘導(dǎo)多種激酶的差異激活

激酶通常通過(guò)識(shí)別特定的序列motif來(lái)磷酸化它們的底物，即磷酸化motif。使用motif-x算法?(https://meme-suite.org/meme/tools/momo)選擇在任意兩個(gè)處理中表現(xiàn)出差異水平的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行磷酸化motif分析。在處理T30/T0之間顯示磷酸化增加的磷酸化位點(diǎn)中，四個(gè)motif?(SP、SDxE、SDxD和LxxxxS)被過(guò)度表達(dá)，而兩個(gè)motif?(SP和RxxS)在顯示磷酸化降低的磷酸化位點(diǎn)中過(guò)度表達(dá)(圖6A)。同樣，在120 min鹽脅迫(T120/T0)下，在磷酸化位點(diǎn)中，分別有4個(gè)motif（SP、SDxE、SDxD和SxxE）和3個(gè)motif（SP、RxxS、SxxE）的水平升高或降低(圖6B)。兩種處理(T120/T30)的比較顯示，在120 min鹽脅迫下，兩個(gè)motif（SP、SD）和motif（SP）在磷酸化位點(diǎn)中被過(guò)度表達(dá)，分別表現(xiàn)出更高和更低的磷酸化水平(圖6C)。

在所有處理中，富含脯氨酸的motif (SP)在上調(diào)和下調(diào)的磷酸位點(diǎn)中都被過(guò)度表達(dá)，并且通過(guò)PRM進(jìn)一步驗(yàn)證了β-淀粉酶1 (BAM1)上含有S55的一個(gè)motif (圖6)。緊接著作者鑒定了5個(gè)CDPKs的12個(gè)磷酸位點(diǎn)和3個(gè)MAPK上的4個(gè)磷酸位點(diǎn)，包括MPK19激活環(huán)上的一個(gè)磷酸位點(diǎn)，這些激酶被認(rèn)為和鹽脅迫相關(guān)。綜上所述，包括MAPKs和CDPKs在內(nèi)的多種激酶在鹽脅迫中起作用。

6.?剪接體蛋白在鹽脅迫下發(fā)生不同程度的磷酸化

除了激酶外，在簇1、2和4中剪接體被KEGG通路顯著富集 (圖5)，暗示磷酸化調(diào)控mRNA的可變剪接，是植物響應(yīng)脅迫的關(guān)鍵過(guò)程。在鹽脅迫下，18個(gè)剪接體蛋白上共有28個(gè)不同的位點(diǎn)被差異磷酸化 (圖7)。利用PRM進(jìn)一步驗(yàn)證了Y209在SCL30上的差異磷酸化(圖6)。據(jù)報(bào)道，RNA解旋酶及其磷酸化對(duì)剪接體的組裝至關(guān)重要。在鹽脅迫30分鐘后，Prp5的S210、S442和S444位點(diǎn)磷酸化增加，并在120分鐘后保持高水平，Prp19的多個(gè)亞基也觀察到類似的磷酸化模式(圖7)。盡管這些差異磷酸化事件的意義尚未得到明確的證明，但它們可能參與了鹽脅迫誘導(dǎo)的mRNA剪接的調(diào)控。

研究總結(jié)

GreenPhos不僅極大地提高了植物磷酸化蛋白質(zhì)組的解析效率，而且也顯著地減低了實(shí)驗(yàn)操作的難度和成本，為更深入地理解蛋白質(zhì)磷酸化在植物生命過(guò)程中的功能提供了強(qiáng)有力的工具。該研究成果將有效推進(jìn)磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)與植物生物學(xué)和農(nóng)學(xué)等領(lǐng)域的交叉融合，在發(fā)掘與作物產(chǎn)量、品質(zhì)以及抗逆密切相關(guān)的磷酸化蛋白及其位點(diǎn)中有著廣泛的應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn)：

Duan?X,?Zhang?Y,?Huang?X,?Ma?X,?Gao?H,?Wang?Y,?Xiao?Z,?Huang?C,?Wang?Z,?Li?B,?Yang?W,?Wang?Y.?GreenPhos,?a?universal?method?for?in-depth?measurement?of?plant?phosphoproteomes?with?high?quantitative?reproducibility.?Mol?Plant.?2023?Nov?27:S1674-2052(23)00393-3.?doi:?10.1016/j.molp.2023.11.010.?Epub?ahead?of?print.?PMID:?38018035.