RNA樣品制備、測序及運輸指南

TRIzol 裂解法：

離心收集的細(xì)胞迅速溶于 TRIzol 裂解，參考用量為每 5 X 10^6 個細(xì)胞加 1 mL TRIzol；細(xì)胞溶于 TRIzol 后，如出現(xiàn)成團(tuán)，需用吸頭將細(xì)胞團(tuán)吹打散，或者激烈震蕩混勻，使細(xì)胞完全溶于 TRIzol 中充分裂解，室溫靜置 5min，之后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時選擇干冰運輸寄送。

液氮速凍法：

離心收集的細(xì)胞直接液氮速凍，速凍 2h 后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時選擇干冰運輸寄送。

2．懸浮細(xì)胞

一次 RNA 提取反應(yīng)所需細(xì)胞數(shù)≤1 X 10^7 個，以 3 X 10^6-1 X 10^7 個為宜，可以將細(xì)胞經(jīng)裂解液裂解后凍存運輸。

1. 確定細(xì)胞生長狀態(tài)良好；離心得到細(xì)胞沉淀（依據(jù)客戶實驗室細(xì)胞離心步驟，注意細(xì)胞離心要適度，不要使細(xì)胞離心過實而造成裂解液不能充分滲透，4 度離心機，轉(zhuǎn)速 3000g

為宜）；

2. 棄去培養(yǎng)基，加入 1 mlLPBS（RNase free，室溫），輕輕將細(xì)胞沉淀懸起， 轉(zhuǎn)移至 2mL 旋蓋尖底離心管（RNase free）中；

3. 離心（依據(jù)客戶實驗室細(xì)胞離心步驟，注意細(xì)胞離心要適度，不要使細(xì)胞離心過實而造成裂解液不能充分滲透，4 度離心機，轉(zhuǎn)速 3000g 為宜）得到細(xì)胞沉淀，棄去 PBS，液氮速凍 2h 之后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時選擇干冰運輸寄送。

運輸方式：干冰運輸。

TRIzol 裂解法：

離心收集的細(xì)胞迅速溶于 TRIzol 裂解，參考用量為每 5 X 10^6 個細(xì)胞加 1 mL TRIzol；細(xì)胞溶于 TRIzol 后，如出現(xiàn)成團(tuán)，需用吸頭將細(xì)胞團(tuán)吹打散，或者激烈震蕩混勻，使細(xì)胞完全溶于 TRIzol 中充分裂解，室溫靜置 5min，之后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時選擇干冰運輸寄送。

全血

1．PAXgene 血液 RNA 管：

用于從 PAXgene Blood RNA Tube 中收集的 2.5 ml 人全血中純化總 RNA。該過程很簡單，可以使用手動或自動程序進(jìn)行。PAXgene Blood RNA Tubes 含有基于 RNA 穩(wěn)定技術(shù)的試劑組合物。該試劑組合物最大程度的保護(hù) RNA 分子降低被 RNase 的降解，并使基因表達(dá)的離體變化最小化。如果 PAXgene 血液 RNA 管為唯一的抽血管，則將血液抽入 PAXgene 血液 RNA 管之前應(yīng)先抽血入“廢棄管”內(nèi)，使抽血過程中所用的采血器內(nèi)能被預(yù)灌注；否則PAXgene 血液 RNA 管應(yīng)為抽血程序中的最后一只試管。確保血液已停止流入試管再從持針器上取下試管（PAXgene 血液 RNA 管內(nèi)的負(fù)壓設(shè)計可向管內(nèi)抽 2.5ml 的血）采血后，立即輕輕顛倒 PAXgene 血液 RNA 管 8-10 次，使添加劑和血液充分混合均勻。

將 PAXgene 血液 RNA 管豎直置于室溫（18-25℃）靜置 2-24 小時，之后可貯藏于-20℃或更低溫度；若試管要貯藏于低于-20℃的溫度，先在-20℃冷凍 24 小時，然后再將其轉(zhuǎn)移到-70℃或-80℃，可保存至少 50 個月。大體積干冰運輸。

2．EDTA 管采集

要求為全血樣本，使用 EDTA 抗凝的采血管采集樣品（由于會影響后續(xù)建庫實驗，禁止使用肝素抗凝），采集血液時，必須經(jīng)過抗凝，避免出現(xiàn)凝結(jié)成塊。新鮮采集好的抗凝血液，用移液器轉(zhuǎn)移到 2mL 離心管中，液氮速凍 2h，干冰寄送。注意：由于 EDTA 抗凝采血管大多為玻璃易碎材質(zhì)，切勿使用采血管原管寄送，以防采血管在運輸轉(zhuǎn)移途中破裂，造成樣品污染、損失。（使用抗凝管采集好的抗凝血液用移液器吸取 500ul 轉(zhuǎn)移到 2mL 離心管中加入 1000ulTRIzol，振蕩儀振蕩 30-60s，室溫孵育 5min 后轉(zhuǎn)到-80 冰箱保存），每個樣本建議送兩管。

動物組織（不含水產(chǎn)類、昆蟲類）

1．液氮速凍法詳細(xì)流程：

1)提前準(zhǔn)備好冷凍組織的足量液氮，預(yù)裝樣品的凍存管，并在做好標(biāo)記（盡量不使用漢字命名，命名字符控制在 5 個以內(nèi)）

2)活體取下新鮮組織，立即剔除結(jié)締組織等非研究所需的組織類型。對腫瘤組織的取材，應(yīng)盡可能準(zhǔn)確地判定腫瘤和正常組織，腫瘤組織應(yīng)將周圍的正常組織切除干凈（正常組織也應(yīng)將周圍的腫瘤組織切除干凈），腸道組織一定要把內(nèi)容物清洗干凈；

3)迅速用預(yù)冷的 PBS 溶液（RNase free）或 0.9%生理鹽水將組織表面的殘留血液沖洗干凈

4)如果組織體積較大，將組織切成長寬高均≤0.5 mm 的小塊（即黃豆大?。?/p>

5)將凍處理好的組織樣本混合均勻后保存于 2 mL 或更大體積的螺口凍存管（RNase free）中，標(biāo)注編號

5)立即（20s 內(nèi)）置于液氮中冷凍 3~4 h，然后轉(zhuǎn)移至-80 °C 長期保存

6)干冰運輸

2．TRIzol 法：

1) 如果使用 TRIzol 裂解液保存送樣，請務(wù)必先進(jìn)行液氮研磨破碎，樣品量取參考標(biāo)準(zhǔn)送樣量的 1/3，然后溶于 TRIzol 中，組織樣品切勿過量；

2) 震蕩混勻，常溫裂解 5 min 后，使用低溫離心機 12000g 離心 10min，將上清液轉(zhuǎn)至新的 2.0ml 離心管中（拍質(zhì)控照片，方便核查），轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，運輸時選擇干冰寄送。

3．RNAlater? Tissue Collection 保護(hù)液法：

1、用 RNAlater? Solution 保存組織之前，需要將組織切割成長寬高均≤ 0.5 mm 的小塊。

2、如果組織帶血液或其他體液，需要過夜后更換一次 RNAlater? Solution；不要將剛浸入RNAlater Solution 中的樣本立即冷凍，需將樣本置于 4 °C 保存過夜（使 Solution 充分浸潤組織樣本），然后轉(zhuǎn)移至-20 °C 或-80 °C 長期保存；

3、RNAlater? Solution 不會影響組織結(jié)構(gòu)，可以把已保存的組織從 RNAlater? Solution 中取出，切下實驗所需的用量，把剩余的組織再放入到原來的保存液中繼續(xù)保存；

4、保存于 RNAlater? Solution 中樣本，-20 °C 存放時，樣本不會結(jié)凍，但可能會有晶體析出，這并不影響后續(xù)的 RNA 提取工作；-80 °C 存放時，樣本會結(jié)凍， 在進(jìn)行 RNA 提取前，需置于冰上融化再進(jìn)行后續(xù)操作，解凍后的樣本可再次放入-80 °C 保存；

5、一般來講，生物樣本保存于 RNAlater? Solution 中，37 °C 可存放 1 天，25 °C（室溫）可存放 1 周，4 °C 可存放 1 個月，-20 °C 或-80 °C 可長期保存。但鑒于生物樣本的特殊性及實驗可重復(fù)性，建議所有保存于 RNAlater? Solution 中樣本，都要置于-20 °C 或-80 °C 長期保存。

植物組織樣品制備指南（不含藻類）

較老組織 RNA 含量低，而且次生代謝物含量相對較高，用于 RNA 提取的成功率低。因此在不影響實驗設(shè)計的前提下，須選擇健康、幼嫩的組織新鮮組織樣采樣流程如下：

1)提前準(zhǔn)備好冷凍組織的足量液氮，預(yù)裝樣品的凍存管，并在做好標(biāo)記（盡量不使用漢字命名，命名字符控制在 5 個以內(nèi)）

2)植物材料取材后用清水將材料表面的灰塵及泥土沖洗干凈，吸干表面水漬，再從植物體上取下新鮮組織。注：如果是需要進(jìn)行處理，請在活體上進(jìn)行處理后再取樣。

3)如果組織體積較大，將組織剪切成 50-100 mg 小塊,約黃豆大小的小塊,放入提前準(zhǔn)備好的凍存管中；

5)立即（20s 內(nèi)）置于液氮中冷凍 3~4 h，然后將單個樣本放于自封袋中，轉(zhuǎn)移至-80 °C 長期保存；

運送方式：干冰運輸。

注：植物組織不建議使用組織保護(hù)液保存。對于一些需要剝?nèi)シN皮處理的，因樣品速凍后無法準(zhǔn)確剔除，如有需要剝?nèi)シN皮的老師須自行操作。

水產(chǎn)類樣品制備指南

水產(chǎn)類包括淡水魚類、海水魚類、貝類、藻類。送樣需要選擇新鮮采集的樣本，海水類物種需要進(jìn)行淡化處理。

取樣注意事項

優(yōu)先選用新鮮采集的樣品送樣，稀有樣本可酌情選取凍存組織。采集樣品時應(yīng)選取核酸含量較多的部位。樣品采集時建議活體取材后用預(yù)冷的 0.9%生理鹽水進(jìn)行漂洗，以去除血漬和污物，將樣品分割成 50 mg 左右的小塊（約黃豆大小，組織塊越小，保存效果越好），樣品分割和處理時應(yīng)盡量在冰上進(jìn)行，防止樣品降解。避免裝樣太滿以至凍裂，造成樣品污染。藻類樣本：大型藻類送樣量（干重）不少于 3g，單細(xì)胞藻類（干重）不少于 1g。注：水產(chǎn)類樣品需盡量保證為新鮮個體。盡量避免寄送保存時間較長或經(jīng)過反復(fù)凍融的組織樣品。針對軟體動物可先使用 75%的乙醇進(jìn)行漂洗，漂洗干凈后液氮冷凍，干冰運輸；針對刺胞動物，可去除頭部和腸道等部位，保留肌肉外壁用于提取。

昆蟲類樣品制備指南

1）昆蟲樣本，需進(jìn)行表面微生物的清洗，較大個體的選取不帶腸道部分的組織，對于較小個體只能用整個個體的，應(yīng)進(jìn)行適當(dāng)?shù)酿囸I處理（注意保證昆蟲的活性）。

2)提前準(zhǔn)備好冷凍組織的足量液氮，預(yù)裝樣品的凍存管，并在做好標(biāo)記（盡量不使用漢字命名，命名字符控制在 5 個以內(nèi)）

3）個體大的，如毛毛蟲，取得活體組織后，用清水清洗，以去除污物，吸干表面液體。將組織樣品分割成約 50 mg 的小塊（約黃豆大?。?，液氮速凍后，放入干凈的帶螺紋旋蓋保存管中；

4) 轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時選擇干冰運輸寄送。

注：小型昆蟲組織務(wù)必在信息單中備注微量樣本需液氮交接防止降解。同時該類樣本因只滿足一次或低于常規(guī)一次提取用量，我們無法保證 100%提取合格。

微生物類樣品制備指南

（一）酵母菌

一次反應(yīng)所需酵母菌的量需≤1 X 10^7 個，以 5 X 10^6-1 X 10^7 個為宜。單次送樣量滿足 3 次以上提取，建議分裝送樣，每管滿足一次提取量，即 3 X 1 X 10^7 個。顯微鏡下觀察酵母菌生長狀態(tài)，收集對數(shù)期生長旺盛的酵母菌將適量體積的酵母菌液轉(zhuǎn)移至將 2 mL 旋蓋尖底離心管（無菌，無核酸酶）中，于室溫下14000 X g 離心 1 min,棄盡培養(yǎng)基，將酵母細(xì)胞沉淀迅速置于液氮中冷凍 3~4 h，然后轉(zhuǎn)移至-80 °C 或液氮中長期保存干冰運輸。

（二）真菌

顯微鏡下觀察真菌生長狀態(tài)，根據(jù)菌類的生長規(guī)律，收集生長旺盛的菌體。真菌樣本在進(jìn)行RNA 提取前，需要進(jìn)行稱重，一次反應(yīng)所需的真菌量為 50 ~100mg（由于不同真菌得率差異較大，所以建議送樣量盡量多或根據(jù)客戶經(jīng)驗得率送滿足 3 次的量）真菌取樣方式以客戶實驗室經(jīng)驗操作即可，要求取樣后到速凍前時間短，菌處于快速生長的活躍期取樣后的真菌置于預(yù)冷的離心管或凍存管中，迅速置于液氮中冷凍 3~4 h，-80 °C 長久保存干冰運輸。

注：請勿直接寄送培養(yǎng)平板，低溫保鮮寄送的真菌培養(yǎng)平板，無法保證菌體的生長狀態(tài)。為了提高真菌菌體 RNA 的提取成功率，應(yīng)將生長旺盛的菌體收集到 2 mL 旋蓋尖底離心管（無菌，無核酸酶）中，迅速置于液氮中冷凍 3~4 h，然后轉(zhuǎn)移至-80℃或液氮中長期保存。

樣品制備注意事項

核酸提取質(zhì)量與物種及組織部位、采集方法及保存狀態(tài)、提取方法及操作、實驗器材及環(huán)境等因素均有密不可分的聯(lián)系，尤其是三代超長提取對樣本的質(zhì)量、總量要求更高，望知悉及理解，并做好樣本備份。為了保障獲得高質(zhì)量的核酸，請務(wù)必按照送樣手冊所規(guī)定的準(zhǔn)備樣本。對珍貴樣本或者微量樣本，建議自行提取。

1) 組織速凍時間：組織離體后，胞內(nèi)核酸便開始降解，尤其是 RNA，故采集時，目的組織離體后，需立即速凍，建議 3min 內(nèi)完成，越快越好。

2) 組織送樣量：建議送樣量適用于 95%的物種組織，少部分組織因胞內(nèi)核酸量較低，需適當(dāng)增加送樣量，比如動物皮膚、毛發(fā)，植物果實、根等。請嚴(yán)格按照上方組織送樣量要求送樣，送樣量過少或過多均不利于提取實驗。采樣量較少會導(dǎo)致提取的 RNA 總量、濃度不合格，采樣量過多反而會造成速凍不徹底、提取取樣困難、凍融降解等危險。

3) 組織保存管的選擇：所有組織樣品務(wù)必使用離心管或螺紋管保存，切勿直接裝入密封袋（低溫凍脆易破裂，導(dǎo)致樣品泄露，交叉污染）保存。

4) 組織樣品保存方法選擇：首選液氮速凍；沒有液氮條件的，可直接放入-80℃冰箱凍存；環(huán)境條件限制的，可使用商組織保護(hù)液保存（這試劑對動物組織可起到一定的效果，植物、菌類、細(xì)胞，微量樣品不可以使用），并嚴(yán)格按相應(yīng)試劑說明操作。

5) 凍融組織： 組織凍存后，一旦凍融，RNA 降解概率大于 80%，幾乎不可能提取成功，此類組織不建議送樣。請各位老師送樣前注意組織保存狀態(tài)， 確保組織未發(fā)生過凍融情況。

6) 長年保存的組織：保存時間超過一年的組織不建議送樣。

7) 組織分離要求：正常組織樣本中不能含有病變組織，而病變組織樣本中也不可以夾帶有正常組織（如目的部位為葉片，就不能含有莖），提取實驗時無法精確取樣，無法稱重。組織量過多的不能全部取樣，只隨機選取適量組織提取。

8) 對于同一個組織樣品需要同時提取 DNA 和 RNA 的，請務(wù)必分成兩管分批次送樣。

9) 樣本的特殊處理:樣本的特殊處理包括：鹽處理、溫度處理、藥物處理、病毒侵染、傷害處理、干旱處理等脅迫處理方式，不同程度的處理對樣本的 RNA 質(zhì)量會造成不同程度的影響，常見的會導(dǎo)致 RNA 的降解或者得率降低。因此，經(jīng)過特殊處理的樣本，在送樣時，務(wù)必請在樣本信息單中進(jìn)行詳細(xì)的備注，以便盡量提高提取的成功率和避免樣本的浪費。

核酸質(zhì)量判定標(biāo)準(zhǔn)

常規(guī) RNA 質(zhì)量判定標(biāo)準(zhǔn)

備注：

1、對于昆蟲、軟體動物等特殊物種，完整性檢測已基線為準(zhǔn)

2、以上均是單個文庫的總量要求，如果樣品做多個文庫按(小 RNA>LNCRNA>轉(zhuǎn)錄組 RNA)判?？偭坎蛔愕奈膸煊袠悠放?C 不通過，無不合格原因，根據(jù)二次提取的總量判定。無樣品根據(jù)剩余總量判判定下一文庫。

樣本制備不足、降解可能存在的風(fēng)險

（一）總量不足或濃度過低存在風(fēng)險

1) 文庫構(gòu)建失敗

2) 文庫產(chǎn)量低不能上機測序或測序數(shù)據(jù)量不足

3) 導(dǎo)致 RNA-seq 數(shù)據(jù)隨機性異常

（二）降解樣本

1) 建庫失敗

2) 導(dǎo)致 RNA-seq 數(shù)據(jù) duplication 比例高、隨機性差

3) 導(dǎo)致 Small RNA rRNA 比例高，影響有效數(shù)據(jù)，文庫片段異常

（三）目標(biāo) RNA 含量低

1) 總 RNA 達(dá)到要求，但由于樣本特異性，small RNA 含量低于正常樣本，導(dǎo)致建庫失敗

2) 總 RNA 達(dá)到要求，但由于處理或組織部位的特異性，mRNA 降解或含量低，導(dǎo)致建庫失敗或者測序數(shù)據(jù)中 rRNA 數(shù)據(jù)比例高

（四）蛋白或其他雜質(zhì)污染

1) 可能影響 Small RNA 電泳分離，造成切膠不準(zhǔn)，影響問題質(zhì)量

2) 可能影響 RNA-seq 磁珠分離導(dǎo)致建庫失敗，或即使達(dá)到上機要求也可能導(dǎo)致文庫隨機性差等問題