前言
1. 適用范圍
本指南介紹百邁客 DNA 類組織樣品的送樣要求及制備方法。采集送樣前請(qǐng)?jiān)敿?xì)閱讀。
2. 聲明
對(duì)于危害程度為第一、二類的高致病性樣品，只接收提取后的核酸樣品，不接收組織 樣。對(duì)于危害程度為三、四類的致病性或傳染性的組織樣，必須先通過銷售或運(yùn)營與醫(yī)學(xué) 實(shí)驗(yàn)平臺(tái)負(fù)責(zé)人溝通，確認(rèn)無高致病和傳染性且能進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)后再安排樣品寄送。危害 程度的判定標(biāo)準(zhǔn)具體參見《人間傳染的病原微生物名錄》 。
3. 提取風(fēng)險(xiǎn)提示
核酸提取質(zhì)量與物種及組織部位、樣本制備、樣本交接、提取方法與操作、以及環(huán)境 等因素息息相關(guān)，故無法完全保證提取質(zhì)量，望老師知悉理解，并做好組織備份。為保障 獲得相對(duì)較高質(zhì)量的核酸，請(qǐng)老師務(wù)必按照以下指導(dǎo)原則準(zhǔn)備樣本。
樣本準(zhǔn)備前注意事項(xiàng)
1. 取樣的代表性
所采集的樣本應(yīng)該通過嚴(yán)格的細(xì)胞學(xué)、組織學(xué)、病理學(xué)等相關(guān)鑒定，因?yàn)檫@關(guān)系到實(shí) 驗(yàn)最終結(jié)果是否具有科學(xué)意義，所以客戶須根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑O(shè)計(jì)相關(guān)科學(xué)取樣方案和取樣步 驟。
2. 取樣的準(zhǔn)確性
正常組織樣本中不能含有病變組織，而病理組織樣本中也不可以夾帶有正常組織。在 條件允許的前提下，爭(zhēng)取做到實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的樣本在取材時(shí)間、部位、 處理?xiàng)l件等方面 盡可能保持一致，否則可能會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性和可信度。 代表性樣本的各種特征數(shù) 據(jù)必須被準(zhǔn)確記錄，并按要求采集、制備、儲(chǔ)存、運(yùn)輸進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理。
3. 取樣的重復(fù)性
生物學(xué)重復(fù)的取樣應(yīng)盡量減少重復(fù)間樣品的差異。在條件允許的前提下，做到重復(fù)樣 本在取材時(shí)間、部位、 處理?xiàng)l件等方面盡可能保持一致，否則可能會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù) 性和可信度。
4. 取樣的及時(shí)性
樣本質(zhì)量是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的最關(guān)鍵因素，因此用于研究的實(shí)驗(yàn)樣本，在采集、貯存、 運(yùn)輸和制備的過程中盡可能地做到迅速，最大限度的縮短從樣本采集到實(shí)驗(yàn)的時(shí)間。
5. 取樣的低溫性
所取樣本離體后，經(jīng)快速清洗和標(biāo)記等處理后，應(yīng)立即投入液氮中速凍至少 3 h，之后 保存于-80 ℃ 冰箱或者干冰中，確保在實(shí)驗(yàn)操作前樣品始終處于-80 ℃，以避免 RNA 的降 解。
組織樣送樣量要求
DNA 提取組織送樣量要求
二代
| SLAF | 重測(cè)序 | 甲基化 | |
|---|---|---|---|
| ?新鮮動(dòng)物組織干重 | 0.5g | 0.5~1g | 1~2g |
| 新鮮植物組織干重 | 0.5~1g | 1~2g | 1~2g |
| 全血 | 1.5ml | 1.5ml | 2ml |
| 菌體（干重） | 1~2g | 1~2g | 1~2g |
三代
| ONT-動(dòng)植物基因組 | ONT-動(dòng)植物重 測(cè)序/甲基化 | PB-動(dòng)植物基因組 | |
|---|---|---|---|
| 肝臟/腎臟等內(nèi)臟組織 | ≥3.5g | ≥0.35g | ?≥3.5g |
| 肌肉 | ≥5.0g | ≥0.5g | ≥5.0g |
| 哺乳動(dòng)物血液 | ?≥5.0mL | ?≥0.5mL | ?≥5.0mL |
| 禽類/魚類血液 | ≥0.5mL | ≥0.1mL | ≥0.5mL |
| 新鮮葉片 | ≥5.0g | ≥0.5g | ≥5.0g |
| 花瓣/莖 | ≥10.0g | ≥1.0g | ≥10.0g |
| 根/種子 | ≥20.0g | ≥2.0g | ?≥20.0g |
| 培養(yǎng)細(xì)胞（細(xì)胞數(shù)） | ≥1×10 8 | ??≥1×10 7 | ??≥1×10 8 |
菌類
| 組織類型/產(chǎn)品類型 | ONT-細(xì)菌/真菌 基因組 | ?PB-細(xì)菌/真菌基 因組 |
|---|---|---|
| 細(xì)菌 | ≥3.5×10 10 | ?≥3.5×10 10 |
| 單細(xì)胞真菌 | ≥3.5×10 10 | ≥3.5×10 10 |
| 大型真菌 | ≥10.0g | ≥10.0g |
* 注：不同類型的組織樣品，DNA 的提取得率差別較大，像人或哺乳動(dòng)物的全血中紅 細(xì)胞沒有細(xì)胞核，每毫升血液中實(shí)用細(xì)胞數(shù)少，DNA 得率比較低，送樣量需相應(yīng)增加；而 鳥類或魚類血液中紅細(xì)胞含有細(xì)胞核，DNA 得率會(huì)增高，送樣量可適當(dāng)減少。含肌纖維細(xì) 胞豐富的肌肉組織以及含多糖多酚較高的復(fù)雜植物，DNA 得率會(huì)受到影響。真菌的細(xì)胞有 含甲殼素（又叫幾丁質(zhì)）為主要成分的細(xì)胞壁，提取難度較大，建議盡量多準(zhǔn)備一些樣品。
核酸送樣要求
1.送樣要求
1.1 術(shù)語及定義
1.1.1 檢測(cè)項(xiàng)目:
m：總量（Total quantity），DNA 的總質(zhì)量
c：濃度（Concentration），DNA 溶液的 Qubit 檢測(cè)濃度
N/Q：Nanodrop 檢測(cè)濃度與 Qubit 檢測(cè)濃度的比值
Size：片段大小（Fragment size），指 DNA 分子片段主帶大小
OD260/280：Nanodrop 檢測(cè)中 OD260 和 OD280 的比值，反映 DNA 純度的指標(biāo)之一
OD260/230：Nanodrop 檢測(cè)中 OD260 和 OD230 的比值，反映 DNA 純度的指標(biāo)之一
1.1.2 樣品質(zhì)量檢測(cè)方法:
Nanodrop：使用 Thermo Fisher NanoDrop 2000/8000 Spectrophotometer 進(jìn)行檢測(cè)的方法
Qubit：使用 Invitrogen Qubit Fluorometer 進(jìn)行檢測(cè)的方法
AGE：Agarose Gel Electrophoresis 即使用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)的方法
1.2 DNA 樣品送樣量要求
請(qǐng)?zhí)峁?DNA 樣品的相關(guān)檢測(cè)結(jié)果，例如以下檢測(cè)手段中的一種或多種檢測(cè)結(jié)果： Qubit、 NanoDrop、 AGE。請(qǐng)采取適當(dāng)?shù)募兓椒ǎ员苊舛嗵?、多酚、蛋白或者核酸酶?duì) DNA 樣品的污染，并詳細(xì)注明溶解 DNA 所使用的溶解液類型。
檢測(cè)結(jié)果說明：
level A：A 類樣品，指純度、片段大小和濃度均合格，總量滿足按數(shù)據(jù)量計(jì)算總量要求的 樣品。
level B：B 類樣品，指純度、片段大小和濃度均合格，總量不完全滿足按數(shù)據(jù)量計(jì)算總量 要求的樣品。
level C：質(zhì)量不完全滿足建庫要求，可以風(fēng)險(xiǎn)建庫但不保證文庫大小與測(cè)序數(shù)據(jù)量的樣品。
level D：質(zhì)量完全不滿足建庫測(cè)序要求，不建議使用的樣品。
請(qǐng)您按照上述 A 類樣品的要求來準(zhǔn)備 DNA 樣品以確保后續(xù)建庫測(cè)序能夠正常進(jìn)行。如果 您準(zhǔn)備的 DNA 樣品不能滿足 A 類樣品指標(biāo)要求，并且后續(xù)不能提供更多的 DNA 樣品， 需要提前聯(lián)系銷售人員進(jìn)行咨詢。
2.二代核酸送樣要求
3.三代核酸送樣要求
樣本制備保存指南
1.植物組織
由于老葉或其它組織 DNA 含量可能較低，而次生代謝物含量一般相對(duì)較高，因此， 為降低 DNA 提取難度并減少污染物干擾，請(qǐng)盡量選擇健康、幼嫩的葉片組織；不建議選 擇易帶有寄生或共生生物的組織，以及不易清洗和研磨的根、莖等組織致密的器官。另外 藻類組織中的水分會(huì)影響提取得率，取樣時(shí)需將組織樣中的水分吸干。新鮮組織樣采樣流 程如下：
1) 用 70%酒精將材料表面的灰塵及泥土沖洗干凈，吸干，再從植物體上取下新鮮組織?
2) 樣品分割成 50~100 mg 左右的小塊，將處理好的組織樣本混合均勻后保存于 2 mL 或更大體積的旋蓋凍存管中；并標(biāo)注編號(hào)。
3) 迅速置于液氮中冷凍 3~4 h，然后按照順序依次放入樣品盒或者按照一定的規(guī)律（例 如 1-10,11-20 等）裝于自封袋中，轉(zhuǎn)移至-80 °C 長(zhǎng)期保存（禁止亂放，尤其是項(xiàng)目 中樣品個(gè)數(shù)較多時(shí)）；干冰運(yùn)輸。
*注：
①一定不要使用自封袋常溫寄送非干燥組織樣，天氣炎熱，高溫下組織樣易腐爛變質(zhì)， 易產(chǎn)生霉菌，導(dǎo)致提取的核酸中混有污染物種的核酸或提取失敗，影響公司成本的同時(shí) 給客戶造成不好的影響。
②干燥樣品現(xiàn)在不建議送樣，提取成功率低，如果只有干燥樣品，使用紙質(zhì)袋裝樣，在 外包裝自封袋中可以統(tǒng)一裝硅膠干燥顆粒。
2.動(dòng)物組織（不含昆蟲和水產(chǎn)類）
1) 活體取下新鮮組織（肌肉、肝臟或其他組織，避免用易于寄生微生物的表皮和腸道、 可能有變異細(xì)胞的病變組織），立即剔除結(jié)締組織和脂肪組織等非研究所需的組織 類型。對(duì)腫瘤組織的取材，應(yīng)盡可能準(zhǔn)確地判定腫瘤和正常組織，腫瘤組織應(yīng)將周 圍的正常組織切除干凈（正常組織也應(yīng)將周圍的腫瘤組織切除干凈）；
2) 迅速用預(yù)冷的 PBS 溶液（RNase free）或 0.9%生理鹽水將組織表面的殘留血液沖洗干凈
3) 如果組織體積較大，應(yīng)盡量將組織切成長(zhǎng)寬高均≤0.5 cm 的小塊（即黃豆大小）
4) 將凍處理好的組織樣本混合均勻后保存于旋蓋的存管中
5) 迅速置于液氮中冷凍 3~4 h，然后轉(zhuǎn)移至-80 °C 長(zhǎng)期保存，送樣時(shí)干冰運(yùn)輸
注：整個(gè)樣品收集過程保證樣品斷血后半小時(shí)內(nèi)完成樣品制備
3.昆蟲
1）昆蟲樣本，建議進(jìn)行表面微生物的清洗，較大個(gè)體的盡量選取不帶腸道部分的組織， 對(duì)于較小個(gè)體只能用整個(gè)個(gè)體的，建議進(jìn)行適當(dāng)?shù)酿囸I處理（但需注意保證昆蟲的活 性）。
2）如果組織體積較大，應(yīng)盡量將組織切成長(zhǎng)寬高均≤0.5 cm 的小塊（即黃豆大?。?/p>
3）將凍處理好的組織樣本混合均勻后保存于旋蓋的存管中
4）迅速置于液氮中冷凍 3~4 h，然后轉(zhuǎn)移至-80 °C 長(zhǎng)期保存，送樣時(shí)干冰運(yùn)輸
*注：蜜蜂送樣時(shí)盡量要求老師取胸部肌肉送樣，整個(gè)蜜蜂送樣提取的核酸狀態(tài)大多數(shù)異常， 影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。不建議送實(shí)驗(yàn)室剔除，因?yàn)榻M織速凍過之后再剔除會(huì)化凍，提取降解的可 能性較大！
4.水產(chǎn)動(dòng)物
1）取得活體組織后，用清水清洗，以去除污物，吸干表面液體；
2）如果是甲殼類（如蝦蟹等），需解剖活體組織，只取軟肉組織，將組織樣品割成約 50 mg 的小塊（約黃豆大?。?/p>
3）液氮速凍后，放入干凈的帶螺紋旋蓋保存管中；
4）轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時(shí)選擇干冰運(yùn)輸寄送。
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5.細(xì)胞
一次提取反應(yīng)所需細(xì)胞數(shù)≤1 X 10 7 個(gè)，以 3 X 10 6 -1 X 10 7 個(gè)為宜，可以將細(xì)胞經(jīng)裂解 液裂解后凍存運(yùn)輸。
1) 從培養(yǎng)箱中取出貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞或懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞，顯微鏡下觀察細(xì)胞，確定生長(zhǎng) 狀態(tài)良好（正常細(xì)胞 confluence 在 80 %左右）
2) 棄去培養(yǎng)基，用 PBS 緩沖液快速洗一次，除去 PBS 緩沖液，貼壁細(xì)胞可用細(xì)胞刮 將其刮下
3) 收集的細(xì)胞轉(zhuǎn)入 1.5 mL 的 EP 管中用液氮速凍后置于-80 °C 保存，一管裝一次提 取的量，可以將備份樣品單獨(dú)裝，禁止將一個(gè)樣品多次提取的細(xì)胞裝到一個(gè)管中， 干冰運(yùn)輸
注：由于細(xì)胞量少，干冰運(yùn)輸務(wù)必保證細(xì)胞處于冷凍環(huán)境，防止環(huán)境溫度增加細(xì)胞降解； 同時(shí)因樣本少易降解，務(wù)必備注信息單微量樣本液氮交接
6.全血樣本
1) 用醫(yī)用抗凝管或已裝有抗凝劑（選用檸檬酸鈉或 EDTA 抗凝劑，不可用肝素）的 旋蓋管收集全血樣本
2) 上下輕輕顛倒混勻十次后，分裝到常規(guī) EP 管中，轉(zhuǎn)移至-20 或-80 °C 長(zhǎng)期保存（實(shí) 際根據(jù)采血管的說明要求操作）
3) 干冰運(yùn)輸
注：
①血液采集管請(qǐng)盡量不要用需專門對(duì)應(yīng)提取試劑盒的采血管，以防送樣后我們因無 對(duì)應(yīng)試劑盒影響提取時(shí)間（盡量送樣前溝通）
②采集完血液之后需將血液轉(zhuǎn)移至 EP 管中，玻璃材質(zhì)采血管冷凍之后易碎不規(guī)范送樣玻璃管破碎 規(guī)范送樣
7.細(xì)菌
注意：所有菌類樣品必須分離好菌體或菌絲送樣，切勿連帶培養(yǎng)基一起寄送，帶培養(yǎng) 基的菌體無法提取。
1）顯微鏡下觀察細(xì)菌生長(zhǎng)狀態(tài)，最好收集生長(zhǎng)期處于對(duì)數(shù)期的細(xì)菌。
2）將適量體積的菌液轉(zhuǎn)移至 2 mL 旋蓋尖底離心管（無菌，無核酸酶）中，于室溫下 14000 ×g 離心 1 min。
3）棄掉培養(yǎng)基，將細(xì)菌菌體沉淀迅速置于液氮中冷凍 1-3 h 以上（凍存時(shí)間視組織量 而定，保證樣品凍存充分），然后轉(zhuǎn)移至-80 °C 長(zhǎng)期保存。
4）將樣品管置于管架上固定好后埋在干冰箱的中間部位，大體積干冰運(yùn)輸。
8.真菌
真菌的形態(tài)多樣，一般分為單細(xì)胞和多細(xì)胞真菌，酵母菌屬于單細(xì)胞真菌，而霉菌和 蕈菌（大型真菌）都屬于多細(xì)胞的真菌。
8.1 單細(xì)胞真菌
單細(xì)胞真菌以酵母菌為代表。一次提取反應(yīng)所需酵母菌的量需≤1×10 7個(gè)，以 5×10 6-1× 10 7個(gè)為宜。您要做的項(xiàng)目要求送樣量較大時(shí)，可以將樣品按上述數(shù)量要求分裝后單獨(dú)保 存。
1）顯微鏡下觀察酵母菌生長(zhǎng)狀態(tài)，最好收集生長(zhǎng)期處于對(duì)數(shù)期的酵母菌。
2）將適量體積的酵母菌液轉(zhuǎn)移至將 2 mL 旋蓋尖底離心管中（無菌，無核酸酶），于 室溫下 14000×g 離心 1 min。
3）棄盡培養(yǎng)基，將酵母細(xì)胞沉淀迅速置于液氮中冷凍 1-3 h 以上（凍存時(shí)間視組織 量而定，保證樣品凍存充分），然后轉(zhuǎn)移至-80 °C 長(zhǎng)期保存。
4）將樣品管置于管架上固定好后埋在干冰箱的中間部位，大體積干冰運(yùn)輸。
8.2 大型真菌
大型真菌因種屬差異，生長(zhǎng)形態(tài)差異很大。在制備大型真菌樣品時(shí)，可參考上述 1.1 植物組織制備方法。
核酸樣本
1) 第一種方案是提取完成后的 DNA 溶液直接放入-20 °C 冰箱中進(jìn)行保存；第二種方案 是采用醋酸鈉乙醇沉淀法沉淀 DNA，并且將樣品直接放入-20 °C 冰箱中進(jìn)行保存； 第三種方案是向沉淀后的 DNA 固體中直接加入 1 mL75 %的無水乙醇，并且將樣品 直接放入-30 °C 冰箱中進(jìn)行保存；第四種方案是提取完成后的 DNA 樣品使用低溫冷 凍儀冷凍成干粉（可常溫運(yùn)輸）
注：推薦用第一種方案
2) 樣品運(yùn)送前保存在-20 °C 冰箱，干冰運(yùn)輸
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