代謝合成途徑研究進展 | 抗AD藥物石杉堿甲的生物合成途徑解析

期刊名稱：PNAS

影響因子：12.779

合作單位：斯坦福大學(xué)

研究部位：根、莖、葉、枝條

研究方法：轉(zhuǎn)錄組、代謝組、體外酶活

研究背景

2021年6月，斯坦福大學(xué) Elizabeth S. Sattely 團隊在國際頂尖學(xué)術(shù)期刊《美國國家科學(xué)院院刊》PNAS發(fā)表一項重要研究成果，題為：A metabolic regulon reveals early and late acting enzymes in neuroactive Lycopodium alkaloid biosynthesis。研究通過代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的方法，確定了一組發(fā)育受控的生物合成基因，或潛在的調(diào)節(jié)子，用于調(diào)控石松生物堿的生物合成。

植物合成了許多能影響哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的小分子化合物，成為治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物先導(dǎo)的重要來源。一些重要神經(jīng)活性植物代謝物是賴氨酸衍生的生物堿，但植物合成這類化合物的機制在很大程度上仍未被闡明。為了更好地理解植物如何合成這些代謝物，作者團隊聚焦于傳統(tǒng)草藥石松（Club moss）Phlegmariurus tetrastichus中石松生物堿（Lycopodium alkaloids）的生物合成研
究。迄今已報道發(fā)現(xiàn)了數(shù)百種石松生物堿，包括乙酰膽堿酯酶抑制劑石杉堿甲（Huperzine A，HupA），其作為阿爾茨海默癥（Alzheimer’s disease，AD）治療藥物引起了科學(xué)家廣泛的研究興趣。

實驗材料

Phlegmariurus屬（以前被歸類為石杉屬）的品種：P. brassii，P. carinata，P. goebelli，P. salvinoides，P. squarrosus和P. tetrastichus，所有植物均在室溫和光照下生長，并偶爾通過去離子水（DI）噴灑其根部來澆水。每周一次，向植物提供直接施用于根部的營養(yǎng)液（Ionic Grow for Soil 3-1-5，Hydrodynamics International）。用于異源基因表達的本氏煙草植株在實驗室環(huán)境溫度下，在生長燈下以 16/8 小時的光/暗循環(huán)在 PRO MIX HP 菌根土壤（Premier Tech Horticulture）中生長。選擇植物在萌發(fā)后 4 至 5 周進行
農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。

1、轉(zhuǎn)錄組實驗

取根、莖、葉、枝條，每組3個重復(fù)。

2、代謝組實驗

取根、莖、葉、枝條，每組3個重復(fù)。

研究結(jié)果

1. 轉(zhuǎn)錄組分析——石松生物堿生物合成研究

為了指導(dǎo)對石松生物堿生物合成的研究，作者重點關(guān)注 HupA，因為它已知具有作為 AChE 抑制劑的活性和作為藥物的潛力。HupA 由石松屬內(nèi)的物種產(chǎn)生，但這些物種的 HupA 積累水平差異很大。作者推斷物種中 HupA 的增加可能與上調(diào)的生物合成基因表達有關(guān)。因此，檢測了石松屬的幾個物種的 HupA 含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)P. tetrastichus（圖 2A）積累了 HupA 到最高水平。因此，后續(xù)的研究將集中在該物種上。之前的研究表明，從頭 HupA 生物合成對P. tetrastichus枝條的新生長具有特異性，接著作者通過氘同位素標(biāo)記實驗得到驗證，并且發(fā)現(xiàn)與莖相比，HupA標(biāo)記在葉中更廣泛分布，表明這里的生物合成基因表達富集（圖2B）。因此，作者對對該物種的多個組織進行了RNA-seq分析，揭示石杉生物堿生物合成基因在活性組織中的積累機制。

為避免從頭轉(zhuǎn)錄組組裝的技術(shù)局限性，作者利用PacBio單分子實時（SMRT） 測序獲得了從 P. tetrastichus組織中分離的RNA的全長互補DNA（cDNA）序列，從而生成參考轉(zhuǎn)錄組，然后對多個植物組織進行轉(zhuǎn)錄組測序。

2.轉(zhuǎn)錄組分析——哌啶基-酮化物中間體合成基因發(fā)現(xiàn)

植物中雜環(huán)亞胺的產(chǎn)生，例如石松生物堿的 1-哌啶前體，涉及 Lys/Orn 氨基酸的脫羧，然后是所得多胺的氧化，這兩者幾乎是植物中常見的代謝過程。賴氨酸脫羧酶 （LDC） 酶和銅胺氧化酶（CAO） 是該途徑早期步驟的基因，作者進一步研究LDC和CAO基因的代謝機制。

通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析，作者發(fā)現(xiàn)了兩個LDC 同源基因（PtLDC-1和PtLDC-2）（圖 2C）和兩個CAO基因（PtCAO-1和PtCAO-2），并且發(fā)現(xiàn)PtCAO基因與 PtLDC基因具有強烈共表達，說明它們參與了相同的代謝途徑，可能與石松生物堿的生物合成相關(guān)。

為了驗證PtLDC和PtCAO基因的功能，在煙草葉片中單獨和共轉(zhuǎn)化。然后通過液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）分析葉提取物，以評估代謝物積累的變化。結(jié)果顯示，兩種 PtLDC 同源基因都顯著升高了尸胺水平（圖 3）。PtCAO同源基因與PtLDC同源基因的共表達導(dǎo)致生成的尸胺消耗和1-哌啶二聚體和三聚體的產(chǎn)生（圖3）。并且發(fā)現(xiàn)同源基因的功能是冗余的，因此在所有后續(xù)實驗中使用PtLDC-2和PtCAO-1產(chǎn)生1-哌啶聚合物。

3.轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析——石松生物堿生物合成中形成 4PAA 和 peletierine 關(guān)鍵酶基因發(fā)現(xiàn)

接下來，推測通過向 1-哌啶聚合物中添加丙二酰輔酶 A 衍生的聚酮鏈以產(chǎn)生 4-（2-哌啶基）乙酰乙酸（4PAA），該酸可以脫羧產(chǎn)生peletierine（圖 1B）。聚酮底物的產(chǎn)生表明聚酮合酶（PKS）酶參與催化這種亞胺-酮縮合反應(yīng)，并在石松生物堿的生物合成中起作用。進一步分析揭示了兩個PKS候選基因（PtPIKS-1和PtPIKS-2），與PtLDC-1共表達基因之一（圖2C）。PtPIKS-1 PtPIKS-2與PtLDC-2 和PtCAO-1在煙草葉片中的瞬時共表達導(dǎo)致1-哌啶代謝物的消耗和幾種新化合物的產(chǎn)生。其中一種化合物具有與假定的石松生物堿前體peletierine相對應(yīng)的精確質(zhì)量數(shù) （[M+H]=m/z
142.1226），并通過與合成標(biāo)準(zhǔn)品的比較來驗證這一點（圖 3）。此外，作者觀察到與4PAA質(zhì)量數(shù)相同的化合物的產(chǎn)生（[M+H]=m/z 186.1125），其結(jié)構(gòu)分配由串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）碎裂支持（圖3）。作者認為 4PAA（一種β酮酸）的自發(fā)脫羧會導(dǎo)致pelletierine的產(chǎn)生，煙草實驗也驗證這一點（圖 3）。綜上所述，PtPIKS-1和PtPIKS-2可能是石松生物堿生物合成中形成 4PAA 和peletierine的關(guān)鍵酶。

為了更好地了解這種亞胺-酮縮合的機制，獲得了兩種PtPIKS同源基因的純化蛋白用于體外分析。與我們在本式煙草中的結(jié)果一致，當(dāng)添加 1-哌啶和丙二酰輔酶 A 作為底物時，PtPIKS-1和PtPIKS-2在體外測定中都產(chǎn)生了4PAA和pelletierine（圖4 A和B），此外還有其他幾種未知化合物。雖然當(dāng)單獨孵育 1-哌啶作為底物時沒有觀察到明顯的產(chǎn)物，但僅向PtPIKS-1添加丙二酰輔酶 A 會導(dǎo)致 3-氧代戊二酸的積累（圖 4 C 和 D）。3-氧代戊二酸的積累表明，PIKS能夠催化兩個丙二酰輔酶A單元縮合成硫酯連接的3-氧代谷氨酰基團，并且該聚酮酸從硫酯鍵上酶促或非酶水解。

4.代謝組學(xué)分析——石松生物堿生物合成中代謝物合成機制

研究報道指出，在石松屬和托烷生物堿生物合成中觀察到的亞胺-酮縮合是通過 3-氧代戊二酸與環(huán)亞胺共底物的非酶促脫羧縮合發(fā)生的。盡管這種非酶縮合是可能的，但作者想進一步評估3-氧代戊二酸作為生物合成中間體的相關(guān)性。為此，比較了在含有PtPIKS-1的體外反應(yīng)中將3-氧代戊二酸或丙二酰輔酶A與1-哌啶配對時 4PAA/peletierine生產(chǎn)的反應(yīng)速率。雖然觀察到1-哌啶和3-氧代戊二酸在低水平下自發(fā)縮合，但當(dāng)丙二酰輔酶A作為與1-哌啶的共底物時，產(chǎn)物形成速率顯著增加（圖4E）。此外，在測量的底物濃度（2至200μM，圖4E），而丙二酰輔酶 A 和 1-哌啶之間的縮合顯然是酶依賴性的（圖4A和B）。因此，雖然1-哌啶和3-氧代戊二酸之間的自發(fā)縮合可以在低水平下發(fā)生，但這些數(shù)據(jù)支持一個model，其中PIKS催化的縮合發(fā)生在1-哌啶和源自丙二酰輔酶A的聚酮硫酯之間。為了支持這一結(jié)論，當(dāng)丙二酰輔酶A作為PtPIKS-1的底物在體外被納入時，可以檢測到累積的乙酰乙酰輔酶A（圖4F）。乙酰乙酰輔酶A的積累雖然是間接的，但表明會產(chǎn)生一種3-氧代戊二酰輔酶A代謝物，該代謝物會迅速發(fā)生脫羧。作者無法直接檢測3-氧代戊二酰輔酶A，并推測這是由于這種中間體的瞬時、不穩(wěn)定性質(zhì)所致。有趣的是，乙酰乙酰輔酶A與1-哌啶發(fā)生酶非依賴性縮合，產(chǎn)生peletierine。然而，這種縮合不會產(chǎn)生4PAA，因此其在石松生物堿生物合成中的相關(guān)性尚不清楚。

通過LC-MS分析無法檢測到與4PAA-CoA硫酯有關(guān)的代謝物。因此，作者考慮了將 3-氧代谷二?；糠种匦录虞d到PtPIKS催化的半胱氨酸上之后發(fā)生亞胺-酮縮合的可能性。為了研究是否存在與PtPIKS-1的催化半胱氨酸結(jié)合的任何?；虚g體，作者用羥胺處理體外酶促反應(yīng)，羥胺已被用于捕獲硫酯中間體作為相應(yīng)的異羥肟酸衍生物。當(dāng)丙二酰輔酶A和1-哌啶作為底物時，作者注意到與4PAA的異羥肟酸相對應(yīng)的質(zhì)量的羥胺（[M+H]=m/z201.1234，圖4G）。這一觀察結(jié)果，以及無法檢測到 4PAA-CoA代謝物，表明存在瞬時酶結(jié)合的4PAA硫酯。

總的來說，這些數(shù)據(jù)支持了這種亞胺-酮縮合的暫定機制（圖4H）：

1） 將丙二酰輔酶A加載到PIKS的催化半胱氨酸上；

2）第二個丙二酰輔酶A與酶結(jié)合的丙二酰基的克萊森縮合，從而形成3-氧代戊二酰輔酶A；

3）將3-氧代谷氨?；糠种匦录虞d到酶上；

4）酶結(jié)合的聚酮與1-哌啶的脫羧縮合，產(chǎn)生酶結(jié)合的4PAA；

5）硫酯水解生成4PAA，在溫和條件下可自發(fā)脫羧生成pelletierine。

雖然需要更多的實驗來揭示該反應(yīng)的精確事件順序和機理細節(jié)，但這些數(shù)據(jù)證明了PIKS在催化石松生物堿生物合成中的亞胺-酮縮合中的關(guān)鍵作用。

5.代謝組學(xué)分析——HupB的后期氧化反應(yīng)

目前研究尚未證實 HupA 生物合成中的任何下游中間體，但從各種苔蘚物種中分離生物堿可能與兩個含8碳哌啶的亞基摻入石松生物堿的生物合成相關(guān)（圖 1B）。但是詳細的代謝合成機制還不清楚。作者通過與4PAA/peletierine生物合成的 3 個高度共表達基因分析，作者發(fā)現(xiàn)了富集最顯著的一類酶：Fe（II）/2-氧代戊二酸依賴性雙加氧酶（2OGDs）（圖2B，C）。作者將這些高度共表達的2OGD作為下游石松生物堿代謝途徑中的強候選基因。

與 HupA 天然共存的多種石松生物堿，包括石杉堿B（HupB）和石杉堿C （HupC），推測是其生產(chǎn)的邏輯途徑中間體，因此可能是潛在的前體（圖 1B）。盡管這些分子之前都沒有被驗證為HupA前體，但在P. tetrastichus的新生長組織中都可以檢測到HupB和HupC，支持了它們作為植物中潛在代謝中間體的結(jié)論。HupB的轉(zhuǎn)化需要C環(huán)哌啶部分的氧化裂解（圖1B）。因此，作者推測2OGD 以及細胞色素P450（CYP）和含黃素的單加氧酶（FMO）參與催化合成HupB。根據(jù)與PtLDC、PtCAO和PtPIKS基因的高共表達基因作為上述基因家族的候選基因，然后通過體外表達候選基因驗證酶的活性功能。結(jié)果顯示，一種 2OGD酶（Pt2OGD-1） 消耗HupB并產(chǎn)生HupC，而第二個2OGD（Pt2OGD-2） 消耗HupC產(chǎn)生 HupA （圖5）。綜上所述，一對2OGD酶負責(zé)通過逐步氧化環(huán)裂解和中性雙鍵異構(gòu)化的氧化還原在石松生物堿生物合成中將HupB轉(zhuǎn)化為HupA。此外，之前的研究報道HupB 和HupC在生產(chǎn)HupA的植物中一直存在，但它們在HupA生物合成中的途徑尚未研究，因此作者的研究結(jié)果證明了它們在該途徑中的中間體作用。

6. 代謝組分析——HupA生物合成途徑下游基因的解析

為進一步研究其他下游生物合成途徑。特別是，兩種石松生物堿，des-N-methyl-α-obscurine（DNMAO）和des-N-methyl-β-obscurine（DNMBO），與HupB共享相同的碳骨架，可能是HupB的前體（圖 5）。因此作者通過與上述已知基因的高共表達分析及體外酶活驗證實驗發(fā)現(xiàn)另一種獨特的2OGD酶（Pt2OGD-3）能將DNMAO轉(zhuǎn)化為DNMBO（圖5），從而形成最終在HupA中發(fā)現(xiàn)的吡啶酮環(huán)。并且發(fā)現(xiàn)Pt2OGD-1和Pt2OGD-2可以依次作用于DNMBO，以產(chǎn)生假定的HupC和HupA的8,15-二氫同系物。Pt2OGD-1不作用 DNMAO，表明在DNMBO和HupB中發(fā)現(xiàn)的吡啶酮環(huán)的存在對Pt2OGD-1底物結(jié)合和/或催化活性至關(guān)重要，但是參與其中的去飽和酶尚未被發(fā)現(xiàn)。

本研究中鑒定的所有三個2OGD均與已發(fā)現(xiàn)的PtLDC-1高度相關(guān)（圖2C）。這些結(jié)果進一步說明了共表達分析可以作為鑒定石松生物堿生物合成調(diào)節(jié)基因的方法，并且這些鑒定的基因很可能在同一代謝途徑中起作用?？傮w而言，通過聯(lián)合使用代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，作者確定了石松生物堿代謝基因的緊密共表達模塊，從而使我們能夠在HupA的生物合成中發(fā)現(xiàn)幾種生物合成酶（圖6）。

研究總結(jié)

本研究揭示了新生長組織中的特異性代謝物生物合成活性以及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表明石松生物堿生物合成的發(fā)育控制。植物生物堿的組織和細胞特異性，并且在新生長組織中生物活性生物堿的產(chǎn)生可能增強了這些易感的新組織免受食草動物的侵害方面的抗性作用。石松科物種的生長緩慢和難以培養(yǎng)，因此通過解析石松生物堿合成途徑，有助于在體外進行大規(guī)模代謝物生產(chǎn)?？偟膩碚f，對HupA生物合成的轉(zhuǎn)錄和生化基礎(chǔ)的深入了解為未來對石松生物堿以及植物產(chǎn)生的許多其他神經(jīng)活性脂肪族生物堿的研究提供了基礎(chǔ)性的理解。