闡明種子傳播的E.gansuensis內(nèi)生真菌增加醉馬草對NaCl脅迫的耐受性分子機(jī)制

中文名:闡明種子傳播的E.gansuensis內(nèi)生真菌增加醉馬草對NaCl脅迫的耐受性分子機(jī)制

英文名:Elucidating the Molecular Mechanisms by which Seed-Borne Endophytic Fungi, Epichlo? gansuensis, Increases the Tolerance of Achnatherum inebrians to NaCl Stress

雜志：IntJMolSci

影響因子：4.556

研究背景

A.inebrians與種子傳播的內(nèi)生真菌Epichlo?gansuensis形成共生關(guān)系，這是其對生物和非生物脅迫的適應(yīng)性和生產(chǎn)力的重要因素。這種共生為A.inebrians提供了幾個優(yōu)勢，包括抗鹽和抗旱性，提高水和氮的利用效率并增加生物量。此外，它還提高了氮代謝的酶活性，耐鎘，清除活性氧和抗病蟲害的能力。植物與Epichlo?內(nèi)生菌的共生可能調(diào)節(jié)生長之間的權(quán)衡和寄主草對非生物脅迫的抗性。這可能是兩者相互作用的結(jié)果，Epichlo?增強(qiáng)寄主草對非生物脅迫的耐受性并促進(jìn)植物生長。與非共生植物相比，共生植物通常表現(xiàn)出更多的分蘗和生物量。Epichlo?gansuensis與Achnatheruminebrians形成穩(wěn)定的關(guān)聯(lián)，是研究本地草和真菌內(nèi)生菌相互作用的理想宿主。

研究目的

高通量測序是一種有效的方法用轉(zhuǎn)錄本來探索原生草對非生物脅迫的反應(yīng)，即使沒有參考基因組序列。以前的研究表明，許多差異表達(dá)寄主草的基因受Epichlo?內(nèi)生菌的影響。在目前的研究中，我們探索了A.inebrians的全長轉(zhuǎn)錄本信息，評估了其作用在200mMNaCl脅迫下E.gansuensis感染對A.inebrians生長的影響并通過Illumina測序在A.inebrians的葉子中確定參與轉(zhuǎn)錄本對醉馬草產(chǎn)生反應(yīng)的基因。研究旨在探索內(nèi)生真菌E.gansuensis感染后NaCl脅迫下宿主草的轉(zhuǎn)錄組，并提供E.gansuensis增加NaCl的寄主草耐受性的分子機(jī)制見解。

材料方法

12Epichlo?gansuensi感染（E+植物）和未感染的種子（E-植物）A.inebrians播種在16個盆中，種子發(fā)芽一周后，每個花盆每周澆150mL1/2Hoagland，同時每個花盆每周澆200毫升蒸餾水。6周后，4個E+苗盆和4個E-苗盆用150mL的1/2Hoagland和0mMNaCl澆灌，4個E+幼苗花盆和4個E-苗盆用150mL的1/2Hoagland與200毫升氯化鈉處理4周；同時對4個E+苗盆和4個E-苗盆每周200mL蒸餾水處理，4個E+苗盆和4個E-苗盆每周用200mL蒸餾水和200mMNaCl。4周后取0mM和200mMNaCl濃度下的E-植物（葉和根混合）的總RNA根據(jù)制造商的方案，通過植物RNA提取試劑盒并用DNaseI消化以去除基因組DNA，用PacBio測序全長轉(zhuǎn)錄組。此外，共有12個RNA樣本來自在0mMNaCl和提取200mMNaCl以通過Illumina測序。提取的RNA檢測和定量使用安捷倫生物分析儀2100和Nanodrop2000。

研究結(jié)果

1、基于SMRT的RNA測序

采用PacBio測序平臺進(jìn)行單分子實(shí)時（SMRT）測序，獲得芨芨草全長轉(zhuǎn)錄組信息。從單個E-植物中收集葉子和根，徹底混合并用于mRNA提取。構(gòu)建了全長cDNA文庫，隨后用SMRT測序（補(bǔ)充圖S1A）。我們獲得了940,319個ROI（總堿基：1,789,709,871），其中包括6.41%的全長嵌合序列和78.55%全長非嵌合序列（補(bǔ)充圖S1B和表S1）。此外，738,588個全長非嵌合序列、60,317個全長嵌合序列和68,878個轉(zhuǎn)錄本，轉(zhuǎn)錄本的平均讀取長度為1832bp。

2、ORF和SSR的預(yù)測

E?A.inebrians總共預(yù)測了34,764個開放閱讀框(ORF)和27,202個完整的ORF。長度分布表明長度為800~1200的ORF為5,926個（補(bǔ)充圖S2）。在大多數(shù)生物體中，簡單序列重復(fù)（SSR）是一個重要的分子標(biāo)記，我們的結(jié)果表明E?A.inebrians檢測到15,945個的SSR，其中大多數(shù)具有單核苷酸重復(fù)、二核苷酸重復(fù)、三核苷酸重復(fù)和四核苷酸重復(fù)（補(bǔ)充表S2）。由于SMRT測序序列的高組裝質(zhì)量，SSR的信息可用于E?A.inebrians未來的遺傳分析和標(biāo)記輔助育種。

3、轉(zhuǎn)錄本的功能注釋和轉(zhuǎn)錄因子的分類

總體而言，94.16%的A.inebrians轉(zhuǎn)錄本在選定的數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行了注釋，并且單個數(shù)據(jù)庫的成功率在41.54%到93.83%之間。GO，KEGG，COG，KOG、Pfam、Swiss-Prot、eggNOG和NR注釋率分別為82.05%、41.54%、42.07%、57.65%、79.78%、68.45%、92.44%和93.83%（補(bǔ)充表S3）。這些結(jié)果表明，大多數(shù)基因是真正轉(zhuǎn)錄的序列，而且很可能A.inebrians中的功能基因。此外，我們獲得了63個轉(zhuǎn)錄基因家族因子（TF）并確定了1536個A.inebrians的推定TF成員（補(bǔ)充表S4)。此外，MYB相關(guān)TF、bHLHTF、NACTF和bZIPTF占大比例（補(bǔ)充圖S3）。

4、E.Gansuensis在各種NaCl濃度下改變了A.Inebrians的轉(zhuǎn)錄本

進(jìn)一步闡明E.gansuensis在NaCl脅迫下對寄主植物生長的分子機(jī)制，E+和E-A.inebrians葉片（28天齡）的轉(zhuǎn)錄組通過Illumina測序進(jìn)行分析。E+A.inebrians和E-A.inebrians用含0mMNaCl和200mMNaCl濃度處理。閾值FDR≤0.01和FC≥2用于確定DEG（差異表達(dá)基因）。結(jié)果顯示響應(yīng)E.gansuensis的轉(zhuǎn)錄本發(fā)生顯著變化，在0mMNaCl和200mMNaCl濃度下的分別發(fā)生2464和1817DEGs（圖1）。此外，在NaCl脅迫下，轉(zhuǎn)錄本發(fā)生了顯著變化，E+葉子的4919個DEG。然而，一個小的轉(zhuǎn)錄組變化發(fā)生在對NaCl脅迫的響應(yīng)，E-葉為502DEG（圖1）。

5、E.Gansuensis調(diào)節(jié)A.Inebrians的不同生物過程以維持生長與抗NaCl脅迫之間的平衡

E.gansuensis上調(diào)1269個基因，下調(diào)1195個0LE+基因（葉E+植物在0mMNaCl下）與0LE-（E-植物在0mMNaCl下的葉子）相比。類似地，E.gansuensis誘導(dǎo)844個基因并抑制200LE+（E+植物的葉子）的973個基因在200mMNaCl下）與200LE-（E-植物的葉子在200mMNaCl下）相比（圖1）。目前的結(jié)果表明在NaCl脅迫下E.gansuensis對基因的調(diào)控有巨大的影響與200mMNaCl相比。對0LE+和0LE-之間的DEGs進(jìn)行GO富集分析發(fā)現(xiàn)，E.gansuensis主要誘導(dǎo)“鈉離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)”、“胚胎后發(fā)育的正調(diào)控”、“蛋白質(zhì)磷酸化”、“光系統(tǒng)化學(xué)計量調(diào)整”和“谷氨酸代謝過程”（圖2A）。此外，GO富集分析表明，類別“類黃酮葡萄糖醛酸化”、“類黃酮生物合成過程”、“氧化-還原”過程”和“陰離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)”在下調(diào)中富集E.gansuensis在0mMNaCl濃度下的DEGs（圖2B）。這些結(jié)果暗示E.gansuensis重新編排了植物生理學(xué)和重要生物學(xué)的許多方面提高寄主植物的競爭力。GO富集分析在200LE+和200LE?之間的DEGs表明，E.gansuensis主要誘導(dǎo)“蛋白質(zhì)磷酸化”、“氧化還原過程”、“油菜素類固醇生物合成過程”、“細(xì)胞鈣離子穩(wěn)態(tài)”和“L-谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)”（圖2C）；此外，GO富集分析發(fā)現(xiàn)“蛋白質(zhì)磷酸化”的類別，“果糖6-磷酸代謝過程”、“類黃酮生物合成過程”和“MAPK”在200mMNaCl濃度下，E.gansuensis在下調(diào)的DEG中富集級聯(lián)”（圖2D）。我們的研究結(jié)果表明，E.gansuensis通過激活細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn)宿主在脅迫環(huán)境下的生長，維持平衡。促進(jìn)ROS、Ca2+信號和油菜素類固醇(BR)的生物合成，它們在抗壓過程中起作用。

6、E.Gansuensis在A.Inebrians兩種氯化鈉濃度中轉(zhuǎn)錄本重排中起的獨(dú)特作用

Venn結(jié)果顯示E.gansuensis僅上調(diào)1135DEG在0mMNaCl濃度下的LE+和LE-之間，E.gansuensis在200mMNaCl脅迫下僅上調(diào)LE+和LE-之間的710DEG；此外，134DEG的LE+與LE-在E.gansuensis在0mMNaCl和200mMNaCl（補(bǔ)充圖S4A）。同樣，E.gansuensis在0mMNaCl和E.gansuensis僅下調(diào)LE+和LE-之間的928DEG僅在A.inebrians中下調(diào)LE+和LE-之間的706DEG作為響應(yīng)至200mMNaCl（補(bǔ)充圖S4B）。分析結(jié)果表明這些特殊的上調(diào)或下調(diào)的LE+與LE-的DEG的GO富集0mMNaCl和200mMNaCl分別顯示磷酸化信號，次生代謝物的合成和轉(zhuǎn)運(yùn)，以及離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)A.inebrians主要富集于E.gansuensis獨(dú)特的上調(diào)DEGs在0mMNaCl濃度下（圖4A）。GO富集分析結(jié)果表明A.inebrians的“蛋白質(zhì)磷酸化”、“類黃酮葡萄糖醛酸化”、“氨基酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)”、“果糖6-磷酸代謝過程”、“類黃酮生物合成過程”和“磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)”主要在200mM甘肅E.gansuensis獨(dú)特的上調(diào)DEG中富集NaCl濃度(圖4C)。細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（“蛋白磷酸化”和“細(xì)胞表面受體信號通路”）、“類黃酮生物合成A.inebrians的“過程”、“細(xì)胞表面受體信號通路”、“葡萄糖輸入”、“陰離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)”和“細(xì)胞分裂”主要富集于E.gansuensis在0mMNaCl和200mMNaCl濃度下共享上調(diào)的DEG（圖4B）。E.gansuensis主要僅抑制“黃酮類葡萄糖醛酸化”、“葡萄糖輸入”、“長鏈脂肪酸代謝過程”、“黃酮類生物合成過程”、“陰離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)”和“氧化還原過程”的A.inebrians，主要在獨(dú)特的下調(diào)DEG中富集由E.gansuensis在0mMNaCl濃度下（圖4D）?！暗鞍踪|(zhì)磷酸化”、“果糖6-磷酸代謝過程”、“黃酮類葡萄糖醛酸化”、“通過果糖-6-磷酸進(jìn)行糖酵解過程”，“類黃酮生物合成過程”，“調(diào)節(jié)蛋白磷酸酶2A型活性”，“鉀離子跨膜”A.inebrians的運(yùn)輸”和“MAPK級聯(lián)”主要富集于獨(dú)特的甘肅大腸桿菌在200mMNaCl濃度下下調(diào)DEG（圖4F）。細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（“蛋白質(zhì)磷酸化”和“細(xì)胞表面受體信號通路”）、次生代謝產(chǎn)物（“類黃酮”生物合成過程”、“絲氨酸家族氨基酸生物合成過程”和“細(xì)胞氨基酸代謝過程”）和“過氧化氫分解代謝過程”A.inebrians主要在0mMNaCl和200mMNaCl的E.gansuensis共享的下調(diào)DEG中富集（圖4E）。

7、NaCl脅迫對A.InebriansE+和E—植物中轉(zhuǎn)錄本重排的獨(dú)特影響

NaCl脅迫僅上調(diào)LE+和LE+之間的2015DEG，且僅NaCl脅迫在LE-和LE-之間上調(diào)139DEG（補(bǔ)充圖S4C）。氯化鈉脅迫僅在LE+和LE+之間下調(diào)4707DEG，NaCl脅迫僅下調(diào)LE-和LE-之間的290DEG（補(bǔ)充圖S4D）。分析結(jié)果這些特殊上調(diào)的DEG在0mMNaCl與200mMNaCl下的GO富集度LE+和LE-分別表明NaCl脅迫主要調(diào)節(jié)氧化還原過程、次生代謝物的生物合成、小分子轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，主要富集在LE+和LE-中獨(dú)特的上調(diào)DEGs（圖5A，C）。例如“氨基酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)”、“類黃酮生物合成過程”、“鉀離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)”、“葡萄糖輸入”、“L-α-氨基酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)”、“陰離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)”、“信號轉(zhuǎn)導(dǎo)”A.inebrians的磷酸化”、“MAPK級聯(lián)”、“氧化還原過程”和“過氧化氫分解代謝過程”主要富集于獨(dú)特的上調(diào)氯化鈉脅迫下LE-中的DEGs（圖5C）。次生物質(zhì)的代謝和運(yùn)輸代謝物（“一元10羧酸代謝過程”、“蛋白質(zhì)分解代謝過程”和“脂質(zhì)代謝過程”），ROS信號（“過氧化氫分解代謝過程”和“細(xì)胞對過氧化氫的反應(yīng)”）和A.inbrians的“蛋白質(zhì)磷酸化”主要富集分別在LE+和LE-之間的NaCl脅迫下共享上調(diào)的DEG（圖5B）。類似地，“蛋白質(zhì)磷酸化”、“類黃酮葡萄糖醛酸化”、“類黃酮生物合成過程”、“氨基酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)”、“鉀離子跨膜”轉(zhuǎn)運(yùn)”、“鈣離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)”和“谷氨酸代謝過程”A.inebrians主要富集在NaCl下LE+中獨(dú)特的下調(diào)DEGs壓力（圖5D）。次生代謝物的合成和轉(zhuǎn)運(yùn)（“黃酮類葡萄糖醛酸化”、“氨基酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)”、“類黃酮生物合成過程”和“長鏈脂肪酸代謝過程”）、“鉀離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)”、“氧化-還原過程”和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑（“磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)”A.inebrians的“MAPKcascade”）主要富集于獨(dú)特的下調(diào)氯化鈉脅迫下LE-中的DEGs（圖5F）。次生物質(zhì)的代謝和運(yùn)輸代謝物（“氨基酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)”、“脂質(zhì)代謝過程”、“氨基酸進(jìn)口”、“糖酵解過程”和“一元羧酸代謝過程”）、“陰離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)”、“氧化還原過程”和“陰離子穩(wěn)態(tài)”。主要富集于LE+和NaCl脅迫下共享的下調(diào)DEGsLE-(圖5E)

8、E.gansuensis在NaCl脅迫下對A.Inebrians轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)模式的影響

E.gansuensis在0mMNaCl下調(diào)節(jié)A.inebrians的16個轉(zhuǎn)錄因子(TFs)濃度，有10個上調(diào)的TF和10個下調(diào)的TF；上調(diào)的TF包括MYB相關(guān)、bHLH、CAMTA、B3-ARF、C2H2、GARP-G2樣、MADS-M型和1個TrihelixTF（補(bǔ)充圖S5A），其中MYB相關(guān)的TF最多與0mMNaCl的其他TF相比，對內(nèi)生真菌敏感。下調(diào)的TF包括GRAS、CPP、HSF、AP2/ERF-ERF、C2C2-LSD、NAC、C3H、bHLH、bZIP和MYB相關(guān)的TF（補(bǔ)充圖S5A）。E.gansuensis影響了A.inebrians的14個TFs200mMNaCl濃度，有5個1112上調(diào)的TF和12個下調(diào)的TF；這上調(diào)的TF，包括HB-HD-ZIP、MYB、NAC、AP2/ERF-ERF、bHLH、bZIP、C2H2、C3H、GARP-G2-like、GRAS、HSF、WRKYTFs和NACTFs受到顯著影響通過200mMNaCl脅迫下的內(nèi)生菌（補(bǔ)充圖S5B）；下調(diào)TF包括3個B3-ARF、1個HB-BELL、1個HB-HD-ZIP、2個MYB和1個NACTF（補(bǔ)充圖S5B）。此外，NaCl脅迫調(diào)節(jié)了LE+中A.inebrians的30個TF，具有23個上調(diào)的TF和17個下調(diào)的TF；上調(diào)的TF包括AP2/ERFAP2、C2C2-CO-like、C2C2-Dof、C2C2-LSD、CPP、FAR1、GARP-G2-like、GRAS、HB-BELL、NF-YC、RWP-RK、WRKY、zf-HD、AP2/ERF-ERF、bHLH、bZIP、C2C2-GATA、C2H2、C3H、HSF、LOB、MYB相關(guān)和NACTF（補(bǔ)充圖S5C）。下調(diào)的TF包括AP2/ERF-ERF、bHLH、bZIP、C2C2-GATA、C2H2、C3H、2HSF、LOB、MYB相關(guān)，NAC、B3、B3-ARF、BES1、HB-HD-ZIP、MYB、Tify和Trihelix，與MYB相關(guān)，NAC和WRYKTFs在LE+中受到NaCl脅迫的顯著影響（補(bǔ)充圖S5C)。NaCl脅迫調(diào)節(jié)LE+中A.inebrians的7個TF，其中2個上調(diào)TFs和5個下調(diào)的TFs；上調(diào)的TF包括兩個WRKY和一個NF-YCTFs，而下調(diào)的TFs包括bZIP、GARP-G2-like、HSF、三種MYB相關(guān)和一個NF-YATF（補(bǔ)充圖S5D）。

9、E.Gansuensis改變與類黃酮生物合成相關(guān)的關(guān)鍵基因的表達(dá)、光合作用、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和氨基酸代謝在氯化鈉壓力下

E.gansuensis顯著激活10個基因和5個光合作用基因分別為0mM和200mMNaCl濃度下。E.gansuensis的作用寄主植物的光合作用基因更明顯在0mMNaCl下比200mM氯化鈉（圖6A）。此外，E.gansuensis顯著激活植物的五個信號傳導(dǎo)基因在0mMNaCl濃度下；這些基因包括乙烯信號通路的兩個基因、生長素信號通路的兩個基因和脫落酸信號通路的一種基因。然而，E.gansuensis沒有顯著激活植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因在200mMNaCl濃度13下(圖6B),這意味著NaCl的影響大于E.gansuensis在植物激素基因表達(dá)方面的研究。E.gansuensis顯著下激活植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因在0mMNaCl濃度下，但E.gansuensis在200mMNaCl濃度下顯著調(diào)控兩個類黃酮生物合成基因(圖6C)。E.gansuensis顯著抑制氨基的八個基因在0mMNaCl濃度和E.gansuensis的酸代謝顯著激活下激活植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因在200mMNaCl濃度下的（圖6D）。更遠(yuǎn)，E.gansuensis顯著下調(diào)甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，以及作為色氨酸代謝在0mMNaCl濃度下。E.gansuensis顯著下調(diào)賴氨酸降解，上調(diào)精氨酸和脯氨酸代謝在200mMNaCl下。因此，很可能，E.gansuensis通過調(diào)節(jié)宿主氨基酸代謝來提高A.inebrians的耐鹽性。

文章亮點(diǎn)

本文通過全長轉(zhuǎn)錄組結(jié)合二代轉(zhuǎn)錄組分析，研究了在NaCl脅迫下，E.gansuensis對宿主A.inebrians的重排生物學(xué)過程產(chǎn)生重大影響以適應(yīng)各種NaCl濃度。結(jié)果表明內(nèi)生真菌重塑宿主的基因表達(dá)以適應(yīng)高鹽環(huán)境，探索了E.gansuensis提高寄主草對NaCl脅迫的耐受性的分子機(jī)制，PacBio測序獲得的轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)主要促進(jìn)了A.inebrians基因注釋，進(jìn)一步推動了基因研究功能。研究證明了內(nèi)生真菌增加宿主對鹽脅迫的耐受性分子機(jī)制，為內(nèi)生菌制造耐鹽草料分子育種提供理論依據(jù)。14