利用OxfordNanopore長讀長RNA-Seq對(duì)發(fā)育中橄欖果蠅胚胎的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究

英文題目：Transcriptome landscape of the developing olive fruit fly embryo delineated by Oxford Nanopore long-read RNA-Seq

中文題目：利用OxfordNanopore長讀長RNA-Seq對(duì)發(fā)育中橄欖果蠅胚胎的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究

研究背景

橄欖果蠅或橄欖蠅（Bactroceraoleae）是栽培橄欖樹主要的害蟲，像所有的昆蟲一樣，橄欖蠅會(huì)完全變態(tài)。然而，尚未探索早期胚胎發(fā)育過程中發(fā)生的轉(zhuǎn)錄動(dòng)力學(xué)，而在沒有完全注釋的基因組的情況下進(jìn)行詳細(xì)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析具有挑戰(zhàn)性。收集發(fā)育前6個(gè)小時(shí)每小時(shí)的橄欖蠅胚胎進(jìn)行ONT測序，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)獲得3100萬reads，與橄欖蠅基因組比對(duì)效率在98%，全長覆蓋率大于50%，在發(fā)育的前六個(gè)小時(shí)中檢測到68％的預(yù)測的基因的表達(dá)。鑒定了3553個(gè)新基因和共79,810個(gè)轉(zhuǎn)錄本，與NCBI預(yù)測的轉(zhuǎn)錄組相比，轉(zhuǎn)錄組多樣性增加了四倍。胚胎發(fā)育的前六個(gè)小時(shí)的特征在于顯著的轉(zhuǎn)錄組變化，每個(gè)胚胎的轉(zhuǎn)錄物總數(shù)從胚胎發(fā)育的第一小時(shí)到第二小時(shí)降至一半?；跁r(shí)間共表達(dá)的基因聚類，在胚胎發(fā)育的前六個(gè)小時(shí)表達(dá)的基因的基因集富集分析顯示參與轉(zhuǎn)錄和翻譯，大分子生物合成和神經(jīng)發(fā)育的基因高度富集?？傊琧DNA分子的全長測序詳細(xì)表征同種型復(fù)雜性和B.oleae的第一胚胎階段的轉(zhuǎn)錄動(dòng)力學(xué)。

結(jié)果分析

1、目前B.oleae基因組組裝和基因組注釋

橄欖蠅有六對(duì)染色體，其中包括一對(duì)異色性染色體，雄性為異性性染色體，最初通過qPCR估計(jì)B.oleae基因組大小在322Mb左右。作者之前提交過一版本基因組，該注釋包含總共13936個(gè)基因和假基因，其中,分別被預(yù)測為蛋白質(zhì)編碼13198，非編碼392和假基因346。此外，預(yù)測2,759個(gè)基因具有可變剪接。而基因和轉(zhuǎn)錄本的平均長度分別為9,597bp和2,259bp，長的基因?yàn)?97,921bp，而長的轉(zhuǎn)錄本為59,475bp。

2、橄欖蠅的轉(zhuǎn)錄組測序鑒定出新的基因和亞型

作者獲得了3100萬次reads，其中使用Canu對(duì)2200萬reads（71％）進(jìn)行了錯(cuò)誤糾正，只關(guān)注全長reads，通過確定為具有5’引物和poly（A）和3’引物的序列全長序列。ToFU轉(zhuǎn)錄組結(jié)果包含總共11,883個(gè)基因和79,810個(gè)亞型（表北京百邁客生物科技有限公司1），其中8330個(gè)基因與NCBI注釋基因匹配，而3553個(gè)基因是新的。所有這些都對(duì)應(yīng)于橄欖蠅轉(zhuǎn)錄組在同種型水平上比當(dāng)前NCBI注釋的四倍擴(kuò)增。針對(duì)UniprotSwiss-prot數(shù)據(jù)庫的預(yù)測蛋白質(zhì)序列的搜索顯示高比對(duì)的是雙翅目，其次是哺乳類動(dòng)物（圖1B）。盡管鑒定了3553個(gè)新基因，但預(yù)計(jì)只有269個(gè)含有開放閱讀框。與注釋基因相比，超過50％的新基因是單外顯子，其中超過80％的基因是多外顯子并且還包含更高百分比的單同種型基因。且新基因的表達(dá)量要低于已注釋基因。在結(jié)構(gòu)上，SQANTI根據(jù)其剪接點(diǎn)和基因組坐標(biāo)將轉(zhuǎn)錄本分為9類，分別為FSM，ISM，NIC，NNC，基因組基因，反義，融合，基因間區(qū)和基因內(nèi)含子（圖1E）。

3、RNA-Seq數(shù)據(jù)的直接標(biāo)準(zhǔn)化優(yōu)于相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化

為了獲得轉(zhuǎn)錄數(shù)，在cDNA合成步驟中以每個(gè)時(shí)間點(diǎn)使用的每個(gè)胚胎數(shù)的恒定比率添加ERCC內(nèi)部加標(biāo)RNA標(biāo)準(zhǔn)。在測序和比對(duì)后，通過2個(gè)步驟實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化，使用Mandalorion對(duì)測序深度進(jìn)行相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化，得到每10000個(gè)映射讀數(shù)的每個(gè)基因讀數(shù)的轉(zhuǎn)錄本豐度（RP10K），我們注意到我們的RNA標(biāo)準(zhǔn)品的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化豐度隨時(shí)間變化，這很可能是由于胚胎中poly（A）RNA含量的變化（圖2A）。在第二步中，我們使用ERCC標(biāo)準(zhǔn)生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線將我們的相對(duì)計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)換為每個(gè)胚胎的計(jì)數(shù)。在這里，我們注意到ERCC標(biāo)準(zhǔn)并沒有隨著時(shí)間點(diǎn)的不同而發(fā)生顯著的變化（圖2B）。有趣的是，與相對(duì)表達(dá)相反，當(dāng)所有基因的每個(gè)胚胎的轉(zhuǎn)錄物的數(shù)量相加并在時(shí)間點(diǎn)上繪圖時(shí)（圖2C和D），該譜與每個(gè)胚胎產(chǎn)生的cDNA相似（補(bǔ)充圖4A），因此驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)化方法。相鄰時(shí)間點(diǎn)北京百邁客生物科技有限公司顯示出比遠(yuǎn)距離時(shí)間點(diǎn)更高的基因表達(dá)相關(guān)性，其中連續(xù)樣本的Spearman相關(guān)性始終等于或高于0.96。

4、胚胎的總mRNA含量和生物學(xué)重復(fù)驗(yàn)證絕對(duì)定量

通過將每個(gè)胚胎的每個(gè)基因的所有轉(zhuǎn)錄物相加并計(jì)算以毫微克計(jì)的當(dāng)量來計(jì)算每個(gè)胚胎的總mRNA（圖3A），總mRNA在1hpo時(shí)從1.2ng/胚胎下降至2hpo時(shí)為0.61ng/胚胎，然后在3hpo時(shí)增加至1.49ng/胚胎，然后在6hpo采樣結(jié)束時(shí)降至0.93ng/胚胎，反映了每個(gè)胚胎的總轉(zhuǎn)錄本（圖2D）。假設(shè)2-5％的總RNA是多腺苷酸化的，mRNA水平與我們在每個(gè)胚胎中獲得的總RNA產(chǎn)量一致。

進(jìn)一步尋求確定觀察到的表達(dá)模式是否可以在不同的生物樣品組中重復(fù)并使用實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR），這是當(dāng)前用于量化基因表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)方法。然而，qPCR基因表達(dá)的相對(duì)方法需要鑒定內(nèi)參基因其表達(dá)在樣品間保持穩(wěn)定。使用作者的數(shù)據(jù)來確定這些常見內(nèi)參基因以及GAPDH的表達(dá)水平的變化，評(píng)估了3個(gè)基因的qPCR表達(dá);SRY，HID和LINGERER，用RPL19和14-3-3zeta作為內(nèi)參基因，在不同的生物重復(fù)樣品組中（跳過6小時(shí)時(shí)間點(diǎn)）。我們觀察到類似的基因表達(dá)趨勢（特別是14-3-3zeta與RPL19相比）。為了進(jìn)一步探索表達(dá)譜，我使用差異表達(dá)的明顯的基因進(jìn)行主成分分析（PCA）和層次聚類分析，第一個(gè)主成分將前3個(gè)時(shí)間點(diǎn)與最后3個(gè)時(shí)間點(diǎn)分開，分層聚類進(jìn)一步表明前3個(gè)和后3個(gè)時(shí)間點(diǎn)是分別共同聚類的。

5、母體到受精卵轉(zhuǎn)變表明胚胎mRNA含量發(fā)生了顯著變化

線蟲，昆蟲，魚類，兩棲動(dòng)物和哺乳動(dòng)物在內(nèi)的許多后生動(dòng)物的發(fā)育胚胎的特征在于顯著的轉(zhuǎn)錄變化，其中之一是胚胎依賴從母體到受精卵轉(zhuǎn)錄物的變化。MZT過程包括兩個(gè)階段，首先是在卵子發(fā)生過程中清除大部分母本轉(zhuǎn)錄本和最初加載到卵母細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，然后開始受精卵轉(zhuǎn)錄。在黑腹果蠅中，MZT已被廣泛研究，胚胎依賴于母體轉(zhuǎn)錄本和蛋白質(zhì)直至受精后2-3小時(shí)。然而，在MZT期間，在2hpf結(jié)束時(shí)，母系編碼的蛋白質(zhì)中有多達(dá)20％的母系供應(yīng)的轉(zhuǎn)錄物不穩(wěn)定，而另外15％的母本轉(zhuǎn)錄本通過化學(xué)編碼的蛋白質(zhì)3hpf不穩(wěn)定。黑腹果蠅母系不穩(wěn)定基因富含細(xì)胞周期功能，而母系穩(wěn)定基因則富含家族保持功能，如代謝，翻譯。

使用我們的時(shí)間進(jìn)程數(shù)據(jù)來闡明MZT在B.oleae中的作用機(jī)制，這個(gè)過程在我們所知的范圍之前還沒有被研究過。我們在檢測跨時(shí)間點(diǎn)的發(fā)育過程中每個(gè)胚胎的總mRNA含量時(shí)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)有趣的現(xiàn)象（圖3A），與1hpo時(shí)相比，2hpo時(shí)每胚胎的總mRNA下降51％，3hpo時(shí)相比2hpo時(shí)增加143％。實(shí)際上，表達(dá)基因的數(shù)量在1,2和3hpo之間是相似的，使用時(shí)間進(jìn)程的數(shù)據(jù)，利用GFOLD在連續(xù)時(shí)間點(diǎn)之間進(jìn)行差異表達(dá)，GFOLD是為沒有生物重復(fù)的樣品設(shè)計(jì)的，已顯示GFOLDlog2倍數(shù)變化與qPCR確定的倍數(shù)變化相關(guān)性較好。使用±0.5的Gfold截止值將基因編碼為上調(diào)或下調(diào)。確定了1496個(gè)基因，這些基因在2hpo時(shí)比1hpo下調(diào)。這些基因富含母體降解的轉(zhuǎn)錄物，在此稱為母體降解的基因。實(shí)際上，在1hpo時(shí)，母體降解基因的表達(dá)水平高于其他基因的表達(dá)水平，與其他基因相比，相同基因在2hpo時(shí)表現(xiàn)出相似的表達(dá)水平，表明這些基因不穩(wěn)定至其他基因的基礎(chǔ)水平。

我們對(duì)3個(gè)類別基因集進(jìn)行富集分析;母體降解基因，受精卵基因和母體穩(wěn)定/上調(diào)基因。母體降解基因也是1hpo中表達(dá)高的基因，富含細(xì)胞過程，發(fā)育和新陳代謝（圖6）。母體降解的基因也富含轉(zhuǎn)錄因子，例如DREF，BEAF-32A，PNR，它們是相應(yīng)的果蠅同源基因。類似母體降解基因，母體穩(wěn)定/上調(diào)基因在翻譯，生物合成過程，基因表達(dá)，代謝過程等方面得到豐富，反映了快速生長胚胎的高代謝活性，DREF轉(zhuǎn)錄因子也在這些基因中富集。受精卵基因富含特定的組織形成和發(fā)展過程，包括：后腸發(fā)育，模式規(guī)范，消化道形態(tài)發(fā)生等功能。

6、基于時(shí)間表達(dá)動(dòng)態(tài)的基因聚類

基因表達(dá)是一個(gè)嚴(yán)格調(diào)控的過程，在胚胎發(fā)育過程中，基因表達(dá)的時(shí)空動(dòng)態(tài)調(diào)控對(duì)器官的正常發(fā)育至關(guān)重要?；谄鋾r(shí)間表達(dá)動(dòng)力學(xué)的基因聚類不僅將表達(dá)基質(zhì)的復(fù)雜性降低為簡單的基因集，而且還可以鑒定具有與先前所示相似的生物學(xué)功能的基因。實(shí)際上，我們鑒定了在不同時(shí)間點(diǎn)表達(dá)達(dá)到峰值的基因，證明了高度動(dòng)態(tài)的轉(zhuǎn)錄本動(dòng)力學(xué)，并表明這些基因在確定的發(fā)育期間具有特定的作用（圖7）。我們進(jìn)一步將這些集群分為3組;1）基因在3hpo達(dá)到峰值并且通常隨時(shí)間降低，稱為早期基因（圖7A），2）基因，其表達(dá)維持3-5hpo，稱為中間基因（圖7B和C），和3）基因其表達(dá)僅在5和/或6hpo時(shí)增加，稱為晚期基因（圖7D）。富集顯示，如先前在母體類別的基因中所觀察到的，早期基因和中間基因在細(xì)胞過程和代謝過程中富集，而晚期基因在專門的發(fā)育過程中富集。

7、長讀長RNA-Seq完善了基因在性別決定途徑中的注釋

雙翅目昆蟲的性別決定機(jī)制在很大程度上是相同的，在果蠅（Drosophilamelanogaster）中，性別決定機(jī)制已被廣泛研究，性致死基因（sxl）作為主要調(diào)節(jié)因子，根據(jù)性染色體與常染色體的比例，調(diào)節(jié)本身和變異基因（tra）的性別特異性選擇性剪接。tra反過來調(diào)節(jié)性別特異性雙重性別的選擇性剪接（dsx），這是級(jí)聯(lián)的最后一個(gè)成員和性別差異發(fā)育的中介。B.oleae同源物已經(jīng)鑒定了sx1，tra和dsx。然而，主要的調(diào)控方式仍然難以捉摸。已經(jīng)提出橄欖蠅的性別決定在胚胎發(fā)育的前6小時(shí)內(nèi)發(fā)生，并且通過類似于黑腹果蠅中的性別決定機(jī)制的tra和dsx的可變剪接來調(diào)控。在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，我們能夠觀察到tra和dsx的各種可變剪接。使用來自成年雄性和雌性頭部的數(shù)據(jù)來識(shí)別性別特異性亞型。在dsx的情況下，與成齡相比，早期發(fā)育階段的亞型復(fù)雜性顯著不同。在數(shù)據(jù)中，看到具有不同轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和長度較長的亞型，因?yàn)樵诎l(fā)育的早期胚胎階段存在突出的亞型（圖8），成齡頭部組織中的這些亞型轉(zhuǎn)移到較短的亞型中，外顯子4存在于雌性中但不存在于雄性中。由于我們無法在早期胚胎階段檢測到這些性別特異性亞型，我們認(rèn)為它們的表達(dá)在發(fā)育過程后期開始。然而，它們在后期階段的積累代表了在發(fā)育早期階段激活的性別調(diào)控系統(tǒng)。北京百邁客生物科技有限公司。

討論

由于受精卵的興趣和令人費(fèi)解的性質(zhì)，胚胎發(fā)育已在模型生物中廣泛研究。然而，在生物中沒有很好表征，長讀長RNA-seq有可能揭示迄今未知的基因，完善注釋信息，并擴(kuò)展亞型多樣性。作者匯集了混合性別橄欖果蠅（Bactroceraoleae）胚胎，這些胚胎在產(chǎn)卵的前6個(gè)小時(shí)后每小時(shí)收集一次。這些時(shí)期的研究很有意義，因?yàn)橹皩?duì)B.oleae的研究表明，在此期間開始通過基因的可變剪接介導(dǎo)的性別決定機(jī)制。此外，來自地中海實(shí)蠅（Ceratitiscapitata）的證據(jù)表明，在此期間發(fā)生極細(xì)胞（原始生殖細(xì)胞）的建立，因此，在此期間闡明轉(zhuǎn)錄狀態(tài)非常重要。

作者在轉(zhuǎn)錄組中包括雄性和雌性頭部以擴(kuò)展轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)?？偟膩碚f，我們的轉(zhuǎn)錄分析工作提供了豐富的資源來識(shí)別早期發(fā)育基因和轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體以及一系列廣泛的可變剪接變體。