Nat Genet項(xiàng)目文章｜高質(zhì)量玉米抗旱種質(zhì)基因組組裝及遺傳解析

2023年2月21日，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)秦峰教授團(tuán)隊(duì)在Nature Genetics在線發(fā)表了題為“Genome assembly and genetic dissection of a prominent drought-resistant maize germplasm” 的研究論文。報(bào)告了玉米抗旱優(yōu)良種質(zhì)基因組CIMBL55組裝和注釋結(jié)果，揭示其優(yōu)良抗旱性的遺傳基礎(chǔ)。中國農(nóng)業(yè)大學(xué)秦峰課題組博士后田甜和博士生王書會為論文共同第一作者，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)秦峰教授為通訊作者。百邁客完成了PacBio、Hi-C測序及相關(guān)分析工作。

研究背景

干旱是制約作物生產(chǎn)的主要逆境因素之一，由于全球氣候變化，自然災(zāi)害頻發(fā)，極端天氣難以預(yù)測，培育高產(chǎn)、抗逆的作物品種的需求比以往任何時(shí)候都更加迫切。玉米(Zea mays)在世界各地廣泛種植，是一種具有巨大現(xiàn)代經(jīng)濟(jì)重要性的植物，可作為食品和替代能源。然而玉米特別容易受干旱的影響，據(jù)估計(jì)，世界上只有約不到5%的玉米種質(zhì)資源在美國的育種項(xiàng)目中得到利用，表明玉米中存在著多種多樣的遺傳資源，可能是培育抗旱品種的優(yōu)良來源。

目前，還未有優(yōu)良抗旱玉米種質(zhì)基因組被破譯，鑒定玉米抗旱種質(zhì)資源，對進(jìn)一步解析玉米抗旱性的遺傳基礎(chǔ)提供依據(jù)，對玉米抗旱性的遺傳改良具有重要意義。

材料方法

基因組：60×RSII、100×Sequel?2、160×BioNano、35×Hi-C

遺傳變異研究：CIMBL55、25個(gè)NAM Founder?lines、SK、Mo17、K0326和A188基因組間變異研究

甲基化：CIMBL55、B73和Mo17全基因組亞硫酸氫鹽測序(BS-seq)

研究內(nèi)容

CIMBL55基因組的組裝與注釋

CIMBL55與B73玉米基因組的基因共線分析

玉米基因組間遺傳變異對抗旱性的影響

表觀遺傳變異對玉米抗旱性的影響

ZmRtn16基因?qū)τ衩卓购敌缘挠绊?/p>

主要研究結(jié)果

1.CIMBL55基因組的組裝與注釋

熱帶/亞熱帶（TST）玉米種質(zhì)CIMBL55具有顯著的抗旱性，在干旱脅迫條件下，與B73和Mo17相比，CIMBL55的苗期存活率高，產(chǎn)量損失小（圖1a-d）。本研究結(jié)合PacBio、Illumina、Hi-C和BioNano光學(xué)圖譜等技術(shù)對其進(jìn)行基因組組裝，最終組裝基因組大小為2,159.5Mb，contig?N50為14.3Mb，scaffold?N50為223.6Mb，隨后，通過Hi-C技術(shù)將scaffold掛載至10條染色體上（圖1e）。BUSCO分析表明，~98%的基因是完整存在的。隨機(jī)挑選9個(gè)BAC序列與基因組組裝比對表明，兩者具有很好的序列同源性。這些結(jié)果表明CIMBL55基因組具有高度完整性和準(zhǔn)確性。CIMBL55、B73、Mo17和SK（另一種TST種質(zhì)）基因組共線性分析發(fā)現(xiàn)，在B73和CIMBL55間存在大的易位、重復(fù)和倒位事件；與B73和Mo17相比，CIMBL55和SK在Chr7上有~440 kb的缺失，在Chr8上有~560 kb的插入，表明這些差異可能在TST種質(zhì)中普遍存在。

基于從頭預(yù)測和同源比對預(yù)測對CIMBL55基因組的重復(fù)區(qū)域進(jìn)行注釋，發(fā)現(xiàn)83.95%的基因組序列為轉(zhuǎn)座子元件?；趶念^預(yù)測、同源比對預(yù)測和轉(zhuǎn)錄組輔助預(yù)測在CIMBL55中共注釋了38,439個(gè)基因，平均基因長度為4,289 bp。Circos圖顯示跨越染色體臂的DNA-TEs和蛋白編碼基因的分布模式相似，RNA-TEs的分布與著絲粒較高的CG和CHG甲基化有關(guān)。

2. CIMBL55與B73玉米基因組的基因共線分析

基因共線性反映了不同基因組間的基因含量及其在染色體上的排列。CIMBL55與B73基因組之間的共線基因分析表明，73%的CIMBL55基因位于共線基因塊，27%的基因是非共線基因。共線基因進(jìn)一步可以分為三類。1類基因(42%)位于B73和CIMBL55的同源染色體上，多數(shù)為單拷貝基因(one-one syntenic)。2類基因(29%)是位于各自基因組中兩條不同同源染色體上的重復(fù)基因(multi–multi synteny)（圖2b）。3類基因(2%)位于CIMBL55當(dāng)前組裝中未定位到染色體上的contigs中，但與B73中的相應(yīng)基因處于共線性塊中。非共線基因包括class 4(16%)和class 5(11%)2類基因。

RNA-seq分析發(fā)現(xiàn)，共線基因比非共線基因具有更高的轉(zhuǎn)錄豐度，表明基因組重排可能影響了基因的表達(dá)（圖2d）。玉米祖先經(jīng)歷了全基因組復(fù)制事件，然后是偏分鎦和二倍化。參考高粱基因組，構(gòu)建了CIMBL55的亞基因組，發(fā)現(xiàn)其偏分鎦與B73一致，支持了玉米進(jìn)化過程的保守性。在CIMBL55的兩個(gè)亞基因組中，有61.5%的2類基因?yàn)槌蓪ΡＡ舻?，表?類基因在玉米進(jìn)化過程中保持相對保守。GO分析發(fā)現(xiàn)，這些基因在多種脅迫的應(yīng)激反應(yīng)中顯著富集。進(jìn)一步對與ABA信號和干旱響應(yīng)相關(guān)基因家族分析發(fā)現(xiàn)，72%的基因?qū)儆?類基因，顯著高于全基因組水平上的2類基因（29%）。這些結(jié)果表明，在玉米進(jìn)化過程中，參與環(huán)境響應(yīng)和適應(yīng)的基因傾向于成對保留。

3.遺傳變異對抗旱性的影響

為了確定CIMBL55抗旱性的遺傳機(jī)理，本研究在泛基因組水平上研究了25個(gè)NAM建立系和另外4個(gè)玉米品系SK、Mo17、K0326、A188的遺傳變異。共得到17,581,014個(gè)結(jié)構(gòu)變異(SVs)（圖3a）。為了更深入地了解CIMBL55的基因組變異，以CIMBL55為參考，在B73和Mo17中鑒定到841,911個(gè)DNA變異(>20 bp)。隨后，在368份玉米自然群體中，成功對544,853個(gè)SVs進(jìn)行了基因型鑒定，并基于干旱后的幼苗存活率對其耐旱性進(jìn)行了分析。

此前研究中，基于全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)和孟德爾隨機(jī)化分析分別鑒定了42個(gè)和97個(gè)抗旱性候選基因。作者在CIMBL55基因組中對這些位點(diǎn)的基因型進(jìn)行研究，鑒定得到108個(gè)抗旱基因。值得注意的是，在CIMBL55中發(fā)現(xiàn)了65個(gè)基因的優(yōu)異單倍型，解釋了CIMBL55優(yōu)良抗旱性的遺傳基礎(chǔ)。此外，在108個(gè)基因中，有11個(gè)候選基因在非CIMBL55等位基因中被鑒定為優(yōu)勢單倍型，這表明其他種質(zhì)可能含有與CIMBL55互補(bǔ)的玉米抗旱性遺傳資源（圖3b）。

研究發(fā)現(xiàn)，位于ZmABF4基因第二內(nèi)含子的SNP (S1474)和SV (S3205, 42 bp)與該基因的表達(dá)和苗期抗旱性密切相關(guān)。ZmABF4編碼bZIP轉(zhuǎn)錄因子，為ABA和干旱誘導(dǎo)表達(dá)的主要調(diào)節(jié)因子。攜帶ZmABF4^CIMBL55等位基因的種質(zhì)在基因表達(dá)和抗旱性方面明顯高于攜帶ZmABF4^B73等位基因的種質(zhì)（圖3d, e）。轉(zhuǎn)基因過表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，與野生型(WT)相比，ZmABF4轉(zhuǎn)基因株系在干旱脅迫下存活率顯著提高，葉片失水率降低（圖3f-h）。說明ZmABF4對玉米抗旱性具有正向調(diào)控作用，?ZmABF4^CIMBL55可能是玉米抗旱性的優(yōu)異等位基因。

4.表觀遺傳變異對抗旱性的影響

對B73、Mo17和CIMBL55三個(gè)材料進(jìn)行全基因組亞硫酸氫鹽測序(BS-seq)，準(zhǔn)確評估其基因組的DNA甲基化狀態(tài)。mCG和mCHG的甲基化水平在全基因組中較高，但在基因邊界處明顯下降。相比之下，包括RNA-TE區(qū)域在內(nèi)的基因組中mCHH水平普遍較低，而DNA-TE元件中mCHH水平較高，表明在這兩種類型的TEs中，CHH甲基化的調(diào)控機(jī)制不同。

基于CIMBL55和B73基因組序列，鑒定SV相關(guān)基因組區(qū)域的差異DNA甲基化。在CIMBL55中鑒定到5,346個(gè)插入序列用于SV相關(guān)DNA甲基化分析。根據(jù)mCG、mCHG和mCHH的水平，將插入序列的DNA甲基化模式聚類為5組（圖4a-c）。其中cluster?4插入片段的mCG、mCHG和mCHH水平明顯高于側(cè)翼序列（圖4b, c）。并且鄰近基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的插入序列具有顯著高的CHH甲基化水平，富集了大量的DTH (DNA Transposon terminal inverted repeat Harbinger)類轉(zhuǎn)座子（圖4b）。

在ZmNAC075的啟動子區(qū)域發(fā)現(xiàn)了差異DNA甲基化。CIMBL55和B73的基因組序列比較發(fā)現(xiàn)，在ZmNAC075^B73的上游區(qū)域有兩個(gè)插入序列，具有較高的甲基化狀態(tài)。此外，攜帶ZmNAC075^B73等位基因的種質(zhì)在干旱脅迫下的基因表達(dá)水平和幼苗存活率明顯低于攜帶ZmNAC075^CIMBL55等位基因的種質(zhì)（圖4e,f）。CRISPR靶向基因敲除結(jié)合全基因組BS-seq分析顯示，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)插入序列的CHH高甲基化狀態(tài)可能抑制基因表達(dá)進(jìn)而影響抗旱性（圖4l）。

5.ZmRtn16可以顯著提高玉米的抗旱性

另外，基因組結(jié)構(gòu)變異分析發(fā)現(xiàn)CIMBL55中ZmRtn16的3′-UTR區(qū)域缺少一個(gè)28bp的插入序列，該變異與干旱脅迫后的幼苗存活率密切相關(guān)（圖5d）。表型分析發(fā)現(xiàn)，該變異影響基因表達(dá)和抗旱性（圖5e, f）。分別從B73和CIMBL55中克隆了3’-UTR序列（包含一個(gè)先前確定的顯著SNP和28 bp的SV）。分析發(fā)現(xiàn)28 bp的插入有利于增強(qiáng)ZmRtn16的表達(dá)豐度，而SNP對其沒有影響。

進(jìn)一步構(gòu)建ZmRtn16過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系，發(fā)現(xiàn)其比WT具有更好的抗旱性（圖5h）。而兩個(gè)CRISPR基因敲除株系中抗旱性較差（圖5i）。過表達(dá)株系葉片失水率較低，葉片氣孔??；而KO株系葉片失水率較高，葉片氣孔更大（圖5h-i）；表明過表達(dá)株系的抗旱性與氣孔大小相關(guān)。比較ZmRtn16-OE、zmrtn16-crispr和WT株系的表型，發(fā)現(xiàn)在干旱條件下，ZmRtn16-OE的抗旱性更好（圖5j）。以上結(jié)果表明ZmRtn16在植物抗旱性中發(fā)揮了積極作用。

為了解ZmRtn16的生物學(xué)功能，亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)ER標(biāo)志物與ZmRtn16-GFP融合蛋白共定位在ER中，表明ZmRtn16-GFP在ER中發(fā)揮作用。免疫共沉淀(co-IP)顯示ZmRtn16能與液泡膜H⁺-ATPase復(fù)合體A (ZmVHA-A)和E3亞基?(ZmVHA-E3)相互作用。隨后，通過比較zmrtn16-crispr和WT株系的ZmVHA-A和ZmVHA-E3亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)ZmRtn16可以促進(jìn)ZmVHA-A和ZmVHA-E3的液泡膜定位（圖6c）。此外，與WT植物相比，ZmRtn16-OE株系液泡質(zhì)子泵活性較高，而ZmRtn16-KO株系液泡質(zhì)子泵活性較低（圖6e），突出了液泡質(zhì)子泵在抗旱性上的作用。綜上所述， CIMBL55基因組中ZmRtn16基因3′ -UTR中28 bp缺失，可能增強(qiáng)ZmRtn16的表達(dá)，促進(jìn)了ZmVHA-A和ZmVHA-E3在液泡膜中的定位，從而提高玉米的抗旱性。

總結(jié)

本研究構(gòu)建了一個(gè)高質(zhì)量的抗旱玉米種質(zhì)CIMBL55的基因組。結(jié)合已發(fā)表的30個(gè)玉米自交系基因組在泛基因組水平上進(jìn)行遺傳變異分析，在108個(gè)先前鑒定的抗旱基因中，CIMBL55中至少攜帶了65個(gè)優(yōu)異等位變異，這可能是構(gòu)成CIMBL55優(yōu)良抗旱性的遺傳基礎(chǔ)。值得注意的是，編碼一種網(wǎng)狀樣蛋白（reticulon-like protein）的ZmRtn16通過促進(jìn)液泡H⁺– ATPase活性來增強(qiáng)抗旱性，突出了液泡質(zhì)子泵在玉米抗旱性中的作用?？傊?CIMBL55基因組的組裝為玉米抗旱性的遺傳解析和改良提供了基礎(chǔ)，為我國和全球的糧食安全提供了支持。