代謝組與微生物組聯合分析方法

微生物組學的研究從最初的單個微生物形態(tài)研究，逐漸深入到微生物的DNA、RNA、蛋白、代謝層面，而這些也衍生出來了一系列的組學研究技術。從初始的形態(tài)學觀測，到DNA層面的擴增子，宏基因組技術研究其微生物組成和功能，進而到宏轉錄組、宏蛋白組、宏代謝組等宏表型組學的研究。多樣性和宏基因組指明【who is there】有哪些微生物和【what are they doing】這些微生物有哪些功能？而蛋白代謝層面，則可以解決【what have really happened】的問題，哪些過程是實際產生的，這些與表型又有著什么樣的關聯。

而近年來，關鍵詞“microbiome and metabolome”、“metagenome and metabolome”也是逐漸備受關注的熱點話題，PubMed搜索發(fā)文量也是逐年上升的趨勢。

那么如何來進行微生物和代謝組聯合分析呢？聯合分析的圖表又怎么解讀？莫慌，本次小編就為大家?guī)碓敿毥榻B。

首先，我們進入百邁客云平臺，打開代謝組分析結題報告，在報告左側找到聯合分析模塊，然后選擇與微生物聯合分析個性化，再在右側選擇需要參與分析的微生物報告，之后進入第二步參數設置，示例圖如下：

第二步參數設置：整體層面選擇相關性分析方法、相關性系數閾值，相關性的p值。一般默認選擇pearson相關性算法，相關性系數0.8，相關性p值選擇0.05。分組對應關系：這里指的是微生物和代謝組的樣本對應關系，比如A組樣本既做了微生物也做了代謝組，那么就選擇代謝組的A組和微生物組的A組放到一起，具體示例圖如下：

提交分析：等待分析完成獲得分析報告結果，一般任務運行周期1-2h。任務運行完成后，在聯合分析結果處查看分析完成的報告和結果，示例圖如下：

結果解讀

微生物和代謝組聯合分析從兩個層面去進行聯合，整體層面去展示微生物和代謝物之間的整體相關性，比如普氏分析、代謝物聚類-菌群相關性分析；從差異層面則基于不同的差異處理組，去進一步聯系表型關系，看具體的微生物和代謝之間的關系是否與生物的表型差異相關，這里則主要有差異代謝物和菌群相關性分析、協慣量分析、典范對應分析、隨機森林分析等，接下來我們就這些分析和大家具體看下怎么解讀和應用。

整體層面

1、普氏分析

普氏分析（Procrustes analysis）是一種多元統計學中的形狀比較分析的方法，即通過分析形狀分布，比較兩組數據一致性。普氏分析是基于匹配兩個數據集中的對應點（坐標），通過平移、旋轉和縮放其中一個數據集中點的坐標以匹配另一數據集中對應點的坐標，并最小化點坐標之間的偏差平方和（表示為M2）。對應點坐標之間的偏差稱為矢量殘差（vector residuals），越小的矢量殘差代表了兩數據集具有更高的一致性。

由于兩組數據集的屬性不同，并不適合用來直接比較，可分別對兩個數據集降維排序分析，并提取特征軸的坐標。本分析選用 PCoA 分別對微生物組（屬水平）和代謝組進行降維排序，之后進行Procrustes分析，比較微生物組與代謝組之間的相似和變異情況。

注：圖中不同顏色代表不同的分組；每個線段代表一個樣本，線段一端實心圓點代表微生物組數據樣本點，線段另一端實心三角形代表相同樣本的代謝組數據樣本點；連線代表兩排序構型的矢量殘差，可評價二者間的變異情況，連線越短，表示兩個數據集之間一致性越高。Monte Carlo Label Permutations P 表示由 Monte Carlo 算法模擬生成的 p-value，p

圖注：Procrustes分析：第一列圖表包含微生物組數據（紅點），第二列包含代謝組數據（綠點）。第一行包含盲腸數據，第二行包含乙狀結腸數據。對盲腸微生物組（A）、盲腸代謝組（B）、乙狀結腸微生物組（D）和乙狀結腸代謝組（E）進行主成分分析。然后進行樣本點間（C和F） Procrustes分析。Procrustes圖上的線越長，表明微生物組和代謝組的對象內差異越大。所示的顯著性值是使用Vegan R軟件包中的protest函數計算的，該函數進行重復的對稱Procrustes分析以估計顯著性。

引用：McHardy I H, Goudarzi M, Tong M, et al. Integrative analysis of the microbiome and metabolome of the human intestinal mucosal surface reveals exquisite inter-relationships[J]. Microbiome, 2013, 1(1): 1-19.

2、雙向正交偏最小二乘法(O2PLS)

雙向正交偏最小二乘法（Two-way orthogonal partial least squares，O2PLS）通過對兩個數據組間的整合分析，評估兩個數據集之間的內在相關性。兩組數據是否可建立O2PLS模型，可判斷數據組間是否存在關聯性。O2PLS模型一方面可反映不同數據組間的整體影響，另一方面可直接體現不同變量在模型中的權重（權重越大，意味著該變量的變化對另一個組學的擾動更劇烈），從而更加精準地發(fā)現關鍵調節(jié)現象。O2PLS 為非監(jiān)督建模，可客觀描述兩數據組間是否存在關聯趨勢，盡可能從源頭上避免假陽性關聯。該方法先對菌落和代謝的數據進行UV scaling預處理，再構建群落和代謝O2PLS模型，計算每個樣本的得分，得到聯合得分圖；然后計算每種微生物和代謝物的載荷值，得到載荷圖。聯合得分圖指示了兩個數據矩陣之間的關系，具有高載荷值的代謝物/微生物被認為是兩個數據集相似性所必需的。最后選擇前兩個維度載荷值長度 top15 代謝物/微生物繪制柱狀圖。

左圖注：圖中點的形狀（圓點和三角形）代表不同分組的樣本，點的顏色代表不同的組學樣本，紅色代表微生物組樣本，藍色表示代謝物樣本，圖中橫縱坐標表示代謝組和微生物組聯合的得分。

中圖注：圖中點的顏色代表不同組學數據，紅色代表微生物，藍色代表代謝物。橫縱坐標表示聯合載荷值。載荷值長度 top15 代謝物/微生物表示為Top，用實心三角形表示，其它的代謝物/微生物表示為Others，用實心圓點表示。

右圖注：圖中展示了載荷值長度 top10 的代謝物和載荷值長度 top15 的微生物，紅色柱子代表微生物，藍色柱子代表代謝物。橫坐標表示聯合載荷軸 1，縱坐標表示代謝物/微生物。

3、代謝物聚類-微生物相關性分析

相關性分析（correlation analysis）是指對兩個或多個具備相關性的變量元素進行分析，從而衡量兩個變量因素的相關密切程度?；谄栠d相關系數，可以度量環(huán)境樣本中物種多樣性與代謝物之間的關聯程度。從整體水平對代謝物和菌群進行相關性分析，相關性分析結果以熱圖，和弦圖，網絡圖三種形式展現。

（1）代謝物簇-微生物相關性熱圖：一種代謝物簇/微生物可能與多種微生物/代謝物簇具有相關性，保留至少含一組相關性的pvalue 滿足 CCP<0.05 的數據，然后進行熱圖的繪制。熱圖可以通過顏色梯度來反應各種代謝物與各個微生物分類之間的相關性大小，并且可以對多樣性和代謝物進行聚類分析。

注：圖右側為微生物（門水平），下方為代謝物簇，左側和上方分別為微生物和代謝物簇的聚類樹狀圖。不同顏色代表皮爾遜相關系數的大小，絕對值越接近于 1，相關性越高。紅色表示正相關，而綠色表示負相關。星號表示代謝物簇和微生物之間顯著性相關（p<0.05），*、**和***表示相關性顯著程度依次增強，分別表示 p<0.05，p<0.01和 p<0.001.

（2）代謝物簇-微生物和弦圖：將top30 頻數的代謝物簇/微生物的相關性結果表，保留至少含一組相關性系數絕對值在Top 30(按照相關系數絕對值從大到小排序)內的數據 ，用于相關性弦圖的繪制。

注：弦圖有兩種形式：文件名含label的和弦圖，代謝物簇/微生物名稱在圈外展示；文件名含legend的和弦圖，代謝簇在左下角展示，微生物在右下角展示。弦圖左半圈為代謝物，右半圈為微生物，每一條弦表示該代謝物與該微生物具有顯著相關性，紅色弦代表正相關，綠色弦代表負相關。弦的寬度越寬，表示與這個代謝物或微生物相關的頻數 count 越多。

（3）代謝物簇-微生物網絡圖：利用代謝物簇-微生物和弦圖的相關性系數表，用于相關性網絡圖的繪制。

注: 圖中代謝物簇用藍色方形標出，微生物用紅色圓形標出。實線代表正相關，虛線代表負相關。

熱圖顯示了ND組和3xtg組的代謝物概況和特定細菌家族和屬的相對豐度之間的關聯。紅到藍的比例：從正到負的關聯。Pearson’s correlations與數據分布一致，經Shapiro-Wilk測試驗證。*p < 0.05.

引用：Sanguinetti E, Collado M C, Marrachelli V G, et al. Microbiome-metabolome signatures in mice genetically prone to develop dementia, fed a normal or fatty diet[J]. Scientific Reports, 2018, 8(1): 1-13.

(A) Procrustes analysis (PA)：連接兩點的線的長度表示兩個數據集之間樣本的一致性。(B) O2PLS模型：O2PLS模型中具有較大的荷載值，被認為是它們相似性的重要因素。(C) 微生物和代謝物之間的spearman相關性的Circos圖。(D) 不同的代謝物和屬于韌皮部的微生物之間的spearman相關網絡。

引用：Ni Y, Yu G, Chen H, et al. M2IA: a web server for microbiome and metabolome integrative analysis[J]. Bioinformatics, 2020, 36(11): 3493-3498.

差異層面

1、差異代謝物-菌群相關性分析

基于差異代謝物和差異菌群（genus 屬水平）進行相關性分析，不對差異代謝物進行降維處理，其他分析原理同整體層面的代謝物聚類-微生物相關性分析。也是以相關性熱圖，和弦圖，網絡圖三種形式展現。

2、協慣量分析

協慣量分析（coinertia analysis）可用于兩組變量的分析，常見于生態(tài)學中研究植被與環(huán)境的關系，隨后被運用到多組學聯合分析中。選擇差異微生物（屬水平），并將微生物將按照門劃分類，結合差異代謝物可展現出差異代謝物和微生物（屬水平）之間的關系，也能體現微生物不同類群間的分布情況，一般情況下同類群的微生物分布相對集中，不同的差異分組中的同類微生物分布可能不同。

3、典范對應分析

典范對應分析（canonical correspondence analysis, CCA），是基于對應分析發(fā)展而來的一種排序方法，將對應分析與多元回歸分析相結合，每一步計算均與環(huán)境因子進行回歸，又稱多元直接梯度分析。將差異代謝物視為環(huán)境因子，與差異菌群（屬水平）進行典型對應分析能揭示菌群的分布特點的同時也能挖掘與之相關聯的代謝物。

左圖注：圖中一個圓代表一個微生物，不同的顏色表示不同的分類（按門劃分，按照門名稱排序，前15個門顯示對應門名稱，其他門通稱為*_other），三角形是代謝物；微生物、代謝物與原點連線形成的夾角反映了代謝物和微生物之間的相關性，銳角為正相關，鈍角為負相關，直角為不相關。

右圖注：圖中的點表示微生物，箭頭為代謝物（為了更清晰的展示代謝物，根據圖幅，統一將箭頭的長度進行了一定比例的縮放），僅展示箭頭長度top5 的代謝物名稱。微生物和原點連線與箭頭形成的夾角反映了代謝物和微生物之間的相關性，銳角為正相關，鈍角為負相關，直角為不相關。

(A) 差異代謝物和OTU之間的相關性分析。(B) 差異代謝物和微生物之間的限制性對應分析。(C) 差異代謝物和微生物區(qū)系之間的相關熱圖。*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001.

引用：Liu X, Sha Y, Lv W, et al. Multi-omics reveals that the rumen transcriptome, microbiome and its metabolome co-regulate cold season adaptability of Tibetan sheep[J]. Frontiers in microbiology, 2022: 887.

4、隨機森林分析

在機器學習中，隨機森林（Random Forest）是一個含多個決策樹的分類器，并且其輸出的類別是由個別樹輸出的類別的眾數而定。在隨機森林中，集成模型中的每棵樹構建時的樣本都是由訓練集經過有放回抽樣得來的。隨機森林構建過程的隨機性能夠產生具有不同預測錯誤的決策樹。通過取這些決策樹的平均，能夠消除部分錯誤。隨機森林建模可以在分類時評估特征的重要性。隨機森林建模被廣泛應用于少樣本、高特征維度的數據集建模中。在多組學聯合分析中，可以通過對模型特征的排序篩選出對模型重要的特征，從而起到篩選biomarker的目的。還可以通過不同組學的單獨建模與合并數據建模的ROC曲線（受試者回歸曲線，Receiver Operating Characteristic curve）對比，評估哪種組學能更好地分離對照組和實驗組。

左圖注：將兩組數據合并建模并按模型特征重要性從大到小排序，圖片顯示top 20的特征，依據K重交叉驗證結果作箱線圖。

右圖注：虛線顯示訓練集K重交叉驗證的平均ROC曲線，實線顯示獨立驗證的ROC曲線。不同顏色虛線和實線分別表示代謝組、微生物組（屬水平）分別建模以及合并建模的ROC曲線。

綠色曲線代表每個小鼠模型內的分類準確性。紫色ROC曲線對應于使用來自ApoE-/-小鼠模型的腸道微生物組（a）和代謝組（b）數據訓練的模型，以預測Ldlr-/-小鼠的IHH暴露。紅色曲線顯示的是在ApoE-/-小鼠上測試的Ldlr-/-小鼠的微生物組（c）和代謝組（d）數據。IHH：間歇性低氧和高碳酸血癥。

引用：Tripathi A, Xu Z Z, Xue J, et al. Intermittent hypoxia and hypercapnia reproducibly change the gut microbiome and metabolome across rodent model systems[J]. MSystems, 2019, 4(2): e00058-19.