動物細(xì)胞圖譜分析繪制方法：單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)

長久以來，生命科學(xué)的研究主要基于群體細(xì)胞水平的分析，隨著單細(xì)胞組學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)，使我們能夠從單個細(xì)胞水平，以前所有未的分辨率去解析其他組學(xué)掩蓋掉的細(xì)胞異質(zhì)性難題和低豐度表達(dá)的分子等信息。如今，越來越多從事動物領(lǐng)域研究的科研工作者，開始利用單細(xì)胞測序技術(shù)來進(jìn)行動物細(xì)胞圖譜、生長發(fā)育、再生機(jī)制、神經(jīng)科學(xué)、生物進(jìn)化、免疫感染等方面的研究。

本次我們給大家?guī)韮善脝渭?xì)胞轉(zhuǎn)錄組技術(shù)助力動物細(xì)胞圖譜繪制的高分文章解讀，希望能給老師后續(xù)的研究提供思路。

動物細(xì)胞圖譜分析繪制案例：黑腹果蠅

中文標(biāo)題：果蠅細(xì)胞圖譜：成年果蠅的單核轉(zhuǎn)錄組圖譜

英文標(biāo)題：Fly Cell Atlas: A single-nucleus transcriptomic atlas of the adult fruit fly

期刊：Science[IF: 63.714] 2022.3.4

DOI：10.1126/science.abk2432

實(shí)驗(yàn)設(shè)計

實(shí)驗(yàn)材料：黑腹果蠅

實(shí)驗(yàn)方法：解剖了來自雌性和雄性黑腹果蠅的12個組織（觸角、體壁、脂肪體、平衡棒、心臟、腸道、腿、馬氏管、絳色細(xì)胞、喙和下顎須、氣管、翅膀）以及3個性別特異性組織（雄性生殖腺、睪丸、卵巢）。對于遍布全身的組織使用特異性GAL4驅(qū)動核-GFP蛋白，再用流式細(xì)胞熒光分選技術(shù)標(biāo)記和收集細(xì)胞核，進(jìn)行單細(xì)胞核snRNA-seq

測序策略：單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組10x Genomics、Smart-seq2

研究內(nèi)容

黑腹果蠅在生物學(xué)研究方面有著豐富的歷史，以往研究探索了其不同組織中的表達(dá)模式，但缺乏細(xì)胞類型分辨率級別的數(shù)據(jù)庫。近年來單細(xì)胞技術(shù)的進(jìn)步使得同時對數(shù)千個細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析成為可能，促進(jìn)了全組織細(xì)胞圖譜的創(chuàng)建。然而，現(xiàn)有scRNA-seq數(shù)據(jù)集來自不同實(shí)驗(yàn)室，是基于不同遺傳背景，不同分離方法以及不同測序平臺產(chǎn)生的，阻礙了跨細(xì)胞和組織的基因表達(dá)的系統(tǒng)性分析。

該研究通過對果蠅多組織進(jìn)行單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組測序后，得到了果蠅細(xì)胞圖譜。之后對15個組織進(jìn)行詳細(xì)的細(xì)胞注釋，在果蠅頭部，注釋到了81種主要的神經(jīng)細(xì)胞類型，在果蠅的軀體中注釋了最豐富的33種細(xì)胞類型。該圖譜還可用于進(jìn)行相同細(xì)胞的跨組織分析，作者通過分析血細(xì)胞在整個組織中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)了血細(xì)胞中最常見的細(xì)胞類型——漿細(xì)胞，并未在成蟲血細(xì)胞中觀察到葉狀血細(xì)胞。通過對肌肉細(xì)胞在不同組織類型進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)它們主要在果蠅軀體、體壁和腿部有特定的富集，并發(fā)現(xiàn)內(nèi)臟肌、骨骼肌、間接飛行肌的分離。

通過轉(zhuǎn)錄因子分析，找到了500個轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞類型具有高特異性，繪制了每種細(xì)胞類型中特異轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)熱圖。此外，作者還使用SCENIC預(yù)測了基于共表達(dá)和motif富集的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。通過對廣泛細(xì)胞類型或組織的基因進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)了在各種細(xì)胞類型中的常見表達(dá)基因和特定表達(dá)基因。

通過對性別依賴的基因表達(dá)和性別特異性組織分析，發(fā)現(xiàn)體細(xì)胞中的主要性別決定基因doublesex（dsx）的表達(dá)在很大程度上不具有性別特異性，而許多其他基因的表達(dá)具有性別依賴。作者進(jìn)一步對精母細(xì)胞和精細(xì)胞進(jìn)行軌跡推斷，發(fā)現(xiàn)精母細(xì)胞期被轉(zhuǎn)錄的基因數(shù)量持續(xù)增加，許多強(qiáng)烈上調(diào)的基因在任何其他細(xì)胞類型中都沒有基本表達(dá)。然而，晚期精母細(xì)胞顯示了來自許多其他細(xì)胞類型的標(biāo)記基因的表達(dá)。

動物細(xì)胞圖譜分析繪制案例：食蟹猴

中文標(biāo)題：食蟹猴單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和調(diào)控組參考圖譜

英文標(biāo)題：A reference single-cell regulomic and transcriptomic map of cynomolgus monkeys

期刊：Nature comuiations?[IF: 17.694]?2022.07.13

DOI：10.1038/s41467-022-31770-x

實(shí)驗(yàn)設(shè)計

實(shí)驗(yàn)材料：成年食蟹猴

實(shí)驗(yàn)方法：選取16個器官（心、肝、脾、肺、腎、胃、結(jié)腸、肌肉、氣管、主動脈、脂肪、膀胱、舌頭、乳腺、子宮和睪丸）

測序策略：10x Genomics單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序（scRNA-seq）和單細(xì)胞染色質(zhì)開放性測序（scATAC-seq）

研究內(nèi)容

非人類靈長類動物（Non-human primates）在系統(tǒng)發(fā)育上與人類非常接近，在遺傳、器官發(fā)育、生理功能、病理反應(yīng)和生化代謝等諸多方面表現(xiàn)出與人類相似的特征，是生物醫(yī)學(xué)研究和藥物開發(fā)的理想實(shí)驗(yàn)動物模型。其中，最為典型的代表當(dāng)屬食蟹猴。系統(tǒng)評估食蟹猴等非人靈長類動物模型與人類的細(xì)胞組成差異、器官異質(zhì)性和基因表達(dá)時空特異性等在基礎(chǔ)研究中具有十分重要的價值。

該研究對成年食蟹猴的16個代表性器官進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序和單細(xì)胞染色質(zhì)開放性測序，構(gòu)建了食蟹猴多器官的單細(xì)胞多組學(xué)參考圖譜，將25萬個細(xì)胞進(jìn)行 t-SNE降維聚類得到40余種不同的細(xì)胞亞群。

通過對該細(xì)胞圖譜進(jìn)行分析，鑒定到了新的細(xì)胞類型。為了解析上皮細(xì)胞異質(zhì)性，作者提取上皮細(xì)胞并進(jìn)行亞群聚類分析。根據(jù)marker基因的獨(dú)特表達(dá)模式，分析鑒定出14個上皮細(xì)胞簇，包括基底細(xì)胞、分泌細(xì)胞、纖毛細(xì)胞和非纖毛細(xì)胞。纖毛上皮細(xì)胞在各種組織中都占很大比例，為了探索纖毛上皮細(xì)胞亞型的發(fā)育和功能動態(tài)，作者選用纖毛上皮細(xì)胞相對較多的器官，使用Monocle和RNA速度分析對纖毛上皮細(xì)胞進(jìn)行軌跡分析，觀察到纖毛細(xì)胞從祖細(xì)胞狀態(tài)向成熟狀態(tài)分化的過程，沿著擬時間高表達(dá)的基因在與代謝過程、細(xì)胞對刺激的反應(yīng)和防御反應(yīng)相關(guān)的基因本體(GO)術(shù)語中順序富集。

使用CellPhoneDB細(xì)胞通訊分析，發(fā)現(xiàn)基質(zhì)細(xì)胞、上皮細(xì)胞和髓系細(xì)胞之間存在強(qiáng)烈的細(xì)胞間相互作用。通常，細(xì)胞間相互作用的強(qiáng)度和模式是器官特異性的。為了重新繪制調(diào)節(jié)細(xì)胞-細(xì)胞相互作用的分子相互作用，作者在不同器官的特定細(xì)胞亞群中繪制了配體-受體對，揭示了猴子各種器官細(xì)胞間通信的潛在分子機(jī)制。

結(jié)合表達(dá)譜和染色質(zhì)開放性數(shù)據(jù)，作者分析預(yù)測了控制不同細(xì)胞類型基因表達(dá)模式的關(guān)鍵調(diào)控子。發(fā)現(xiàn)SPIB、POU2F2、SPI1、CEBPD和IRF4是髓系細(xì)胞中的關(guān)鍵調(diào)控子；而FEV具有調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞的潛能，該轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與對免疫細(xì)胞和上皮細(xì)胞的基因表達(dá)調(diào)控。大多數(shù)順式調(diào)控元件(CREs或ATAC峰)來自啟動子、內(nèi)含子或遠(yuǎn)端基因間調(diào)控區(qū)。在scATAC-seq數(shù)據(jù)中預(yù)測了9種細(xì)胞類型，在RNA簇中發(fā)現(xiàn)了兩種罕見的細(xì)胞類型，單核細(xì)胞和循環(huán)B細(xì)胞，但在ATAC簇中沒有發(fā)現(xiàn)。總之，本文中的scATAC-seq數(shù)據(jù)為無偏見地發(fā)現(xiàn)食蟹猴的細(xì)胞類型和調(diào)控DNA元件提供了豐富的資源。

最后，作者進(jìn)行了跨物種比較分析，通過整合分析器官匹配的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，探討了人、食蟹猴和小鼠三個物種之間的細(xì)胞組成和基因表達(dá)特異性。猴子和人類在同源基因表達(dá)方面表現(xiàn)出明顯高于其他比較的細(xì)胞類型相似性。其中，免疫細(xì)胞相較于非免疫細(xì)胞，人類和猴子之間的基因表達(dá)具有更高的相似性。間質(zhì)細(xì)胞在人鼠和猴鼠比較中表現(xiàn)出最高的相似性。這些發(fā)現(xiàn)表明，猴子在免疫系統(tǒng)中與人類具有高度相似的轉(zhuǎn)錄程序，因此可能為研究對癌癥或新冠病毒COVID-19等疾病的免疫反應(yīng)提供理想的模型。

 

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