視網(wǎng)膜基因研究：Hi-C技術(shù)繪制高分辨率人類視網(wǎng)膜3D基因組拓撲結(jié)構(gòu)圖譜

在過去視網(wǎng)膜疾病的全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）發(fā)現(xiàn)常見的變異主要在基因組非編碼區(qū)域，但由于先導(dǎo)變異區(qū)域的局部連鎖不平衡（LD），阻礙了特定關(guān)聯(lián)基因和變異的識別，因此闡明與性狀相關(guān)的遺傳變異如何影響調(diào)節(jié)基因表達網(wǎng)絡(luò)，并因此影響表型，亟需了解相關(guān)組織和細胞類型的3D基因組拓撲結(jié)構(gòu)。

近日，來自美國NIH國家眼科研究所Anand Swaroop團隊通過Hi-C技術(shù)繪制了人類視網(wǎng)膜細胞染色質(zhì)三維結(jié)構(gòu)圖譜，揭示了人類視網(wǎng)膜中超級增強子（SEs）的3D染色質(zhì)組織的特性，并將得到的視網(wǎng)膜基因組調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與通過GWAS識別的老年性黃斑變性（AMD）和青光眼相關(guān)的數(shù)量性狀基因座（quantitativetraitloci, QTL）和遺傳變異相結(jié)合，揭示了順式調(diào)控元件(CREs)的靶標(biāo)，表明了人類視網(wǎng)膜中SEs的3D染色質(zhì)組織的特性。此次人類視網(wǎng)膜高分辨率基因組結(jié)構(gòu)的研究為組織特異性功能的遺傳調(diào)控提供了新見解，并能夠解剖常見的致盲疾病表型。

研究背景

在不同組織和細胞類型中人類基因組染色質(zhì)結(jié)構(gòu)增強子-啟動子相互作用建立了獨特的時空基因表達模式。非編碼遺傳變異可以通過染色質(zhì)空間構(gòu)象從而調(diào)控基因表達來影響細胞表型。為了闡明人類視網(wǎng)膜的基因組調(diào)控，利用Hi-C技術(shù)以高分辨率揭示染色質(zhì)并與超級增強子（SE）、組蛋白標(biāo)記、CTCF結(jié)合和選擇轉(zhuǎn)錄因子相互作用，表明與邊緣SE的TAD相比，具有中心SE的拓撲相關(guān)結(jié)構(gòu)域（TAD）表現(xiàn)出更強的絕緣性，并與視網(wǎng)膜基因的接觸增強。全基因組表達數(shù)量性狀位點（eQTL）分析與拓撲圖相結(jié)合，揭示了100個eQTL和與視網(wǎng)膜神經(jīng)變性相關(guān)的相應(yīng)eGene之間的聯(lián)系，并發(fā)現(xiàn)了與年齡相關(guān)的黃斑變性和青光眼相關(guān)的易感變異的候選基因。對人類視網(wǎng)膜高分辨率基因組結(jié)構(gòu)的研究為組織特異性功能的遺傳控制提供了見解，提出了缺失遺傳性的模式，Hi-C組學(xué)技術(shù)為識別視網(wǎng)膜相關(guān)疾病表型提供有利工具。

研究設(shè)計

材料：一共取材5名患者捐贈視網(wǎng)膜組織（2名女性，3名男性，年齡65-77歲）;Hi-C互作取3名男性和1名女性視網(wǎng)膜組織以及HCT116細胞系；CUT&RUN取1名75歲的女性外周視網(wǎng)膜組織；ATAC-seq取2名女性和3名男性視網(wǎng)膜組織。

方法：Hi-C互作(5kb)、ATAC-seq、Cut&Run、ChIP-seq（數(shù)據(jù)集：GSE13731134）、RNA-seq（數(shù)據(jù)集）

文章亮點

1）本文整合表觀調(diào)控全面的技術(shù)，利用Hi-C互作、ATAC-seq、Cut&Run、ChIP-seq等多組學(xué)不僅重構(gòu)了視網(wǎng)膜基因組拓撲結(jié)構(gòu)，還深入剖析了三維結(jié)構(gòu)對基因調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)；

2）視網(wǎng)膜調(diào)控基因組拓撲結(jié)構(gòu)與AMD和青光眼相關(guān)遺傳變異的首次詳細整合；

3）高分辨率的基因組結(jié)構(gòu)圖像(5kb)，深入研究常染色質(zhì)A/異染色質(zhì)B區(qū)域、TAD邊界、Loop形成的變化；

4）利用GWAS、eQTL等疾病性狀關(guān)聯(lián)分析建立與視網(wǎng)膜神經(jīng)變性相關(guān)的相應(yīng)eGene之間的聯(lián)系。

主要研究內(nèi)容

1、Hi-C測序以5kb高分辨率識別人類視網(wǎng)膜中的染色質(zhì)空間構(gòu)象

利用Hi-C技術(shù)檢測了4名眼科相關(guān)疾病患者的視網(wǎng)膜組織，以超高的分辨率（5kb）的重新繪制了人類視網(wǎng)膜細胞染色質(zhì)的組織（每個視網(wǎng)膜樣本的測序深度約為3億對reads，HCT116的深度約為5000萬對read）。分析表明Hi-C數(shù)據(jù)在樣本間表現(xiàn)出高度的相似性，所有常染色體的分層相關(guān)系數(shù)(SCC)>0.97。整合所有樣本的數(shù)據(jù)一共獲得了11.48億對reads,其中有效互作reads的比例高達95%，不同染色體之間的互作trans占23.6%。

此次研究總共獲得了7.04億個有效染色質(zhì)互作，這些染色質(zhì)互作平均分布在染色體之間和染色體之內(nèi)。

本文Hi-C以3 kb的高分辨率識別出67,841個顯著的染色質(zhì)互作和2948個拓撲關(guān)聯(lián)域（TADs）、以及60000多個loops的形成。如預(yù)測一樣，視網(wǎng)膜中活躍表達的基因在A Component染色質(zhì)區(qū)域，而大多數(shù)低活性的基因出現(xiàn)在B Component中，檢測全基因組loop環(huán)結(jié)構(gòu)特征發(fā)現(xiàn)，在A-A互作、A-B互作、B-B互作形成loops三種模式中，A-A互作形成loops距離小于B-B互作和A-B互作形成的loops，并且A-A形成的loops都是活躍的染色質(zhì)區(qū)域，跨度平均小于1Mb，大多數(shù)都是發(fā)生在TAD內(nèi)。

2、人視網(wǎng)膜染色質(zhì)拓撲結(jié)構(gòu)具有組織特異性和物種保守性

為了評估已識別的染色質(zhì)特征在人視網(wǎng)膜組織特異性和物種保守性，這里比較了人類神經(jīng)元（ACC）、GM12878淋巴細胞（LCL）、結(jié)腸癌細胞（HCT116，clone cancer）Hi-C測序數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜特異性基因，如OTX2、EYS、PDC，只存在于視網(wǎng)膜的A component；由于視網(wǎng)膜和ACC神經(jīng)元之間的高度相關(guān)性，比較發(fā)現(xiàn)PAX6基因座在神經(jīng)元和視網(wǎng)膜中的相互作用與其在兩個組織中的表達相似，而編碼OTX2和CRX兩個關(guān)鍵的視網(wǎng)膜TF，在視網(wǎng)膜中表現(xiàn)出大量的局部相互作用，但在神經(jīng)元中沒有，表明人視網(wǎng)膜組織拓撲關(guān)聯(lián)域具有組織特異性，并在基因調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。

小鼠和人類染色質(zhì)組織之間的相似性表明了跨物種的守恒，強調(diào)了染色質(zhì)組織模式與視網(wǎng)膜基因調(diào)控的相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)小鼠TAD中21.8%的小鼠基因?qū)σ参挥谙鄳?yīng)的人類TAD中，超過三分之一（35.7%）的基因?qū)υ谛∈篌w內(nèi)通過染色質(zhì)環(huán)相互作用，在人類視網(wǎng)膜中也是如此。

在這兩個物種中，EGF和ENPEP之間都觀察到loops的形成，這些發(fā)現(xiàn)表明，視網(wǎng)膜表達的基因表現(xiàn)出保守的染色質(zhì)拓撲結(jié)構(gòu)，突顯了其對調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜基因的重要性，并可能涉及組織特異性順式調(diào)控元件CREs。

3、視網(wǎng)膜中SE與高度表達的組織特異性基因重疊，并富集視網(wǎng)膜TF結(jié)合motfis

染色質(zhì)互作形成的loops促進CRE與其目標(biāo)基因之間的物理相互作用，并且在控制基因表達方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。為了識別視網(wǎng)膜CRE，利用染色質(zhì)可及性檢測（ATAC-seq）確定了染色質(zhì)開放狀態(tài)和CUT&Run檢測活性（H3K4me3，H3K27Ac，H3K4me234）和抑制性（H3K9me3）組蛋白標(biāo)記互作的特征序列。通過全基因組染色質(zhì)開放程度以及開放區(qū)域（啟動子、增強子、異染色質(zhì)、低豐度信號）構(gòu)建了10種染色質(zhì)狀態(tài)模型，啟動子和增強子區(qū)域富集了用于結(jié)合CTCF和關(guān)鍵視網(wǎng)膜TF，如CRX、NRL、OTX2、MEF2D、CREB和RORB，另外增強子主要在TSS上游區(qū)域富集，而啟動子僅在TSS富集。

利用H3K27Ac蛋白標(biāo)記互作在視網(wǎng)膜順式調(diào)控元件啟動子和活性或穩(wěn)定增強子區(qū)域鑒定了1325個超級增強子（SEs），發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜表達基因的數(shù)量與每個染色體的SE數(shù)量之間存在高度相關(guān)性。SE與轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)集結(jié)合分析表明，與CRE相比，SE重疊的基因的平均表達量高2.17倍，并且比100組隨機SE大小的位點高2.89倍，視網(wǎng)膜中關(guān)鍵的光感受器特異性基因NRL主要在活性組蛋白標(biāo)記和染色質(zhì)開放區(qū)域的大型SE中富集，與CRE或隨機區(qū)域相比，TF結(jié)合位點主要存在于SE中，其中編碼許多具有豐富結(jié)合基序TF的基因也與SE重疊，這表明它們在維持視網(wǎng)膜穩(wěn)態(tài)方面的潛在作用。

4、SE在TAD內(nèi)部loops富集并參與基因表達調(diào)控

以往研究表明SE可能會與其他調(diào)節(jié)區(qū)域互作，形成能夠調(diào)節(jié)多個基因的大型轉(zhuǎn)錄單元。視網(wǎng)膜SE在距離較小的loops中富含，并廣泛存在與loops內(nèi)的互作，幾乎所有SE參與內(nèi)部互作的loops都小于1Mb，并且大多數(shù)SE主要在TAD中存在交互。

與隨機區(qū)域相比較，SE在調(diào)節(jié)相互作用中大量富集，與3,059個獨特的CRE、1個獨特的TSS和217個獨特的SE互作。在視網(wǎng)膜和/或大腦中特異性表達的基因大多與SE重疊，而與SE相互作用但不重疊的基因則是一些常規(guī)基因，也有一些SE與許多CRE相互作用，因此可能在協(xié)調(diào)基因表達模式方面發(fā)揮重要作用，這些結(jié)果均表明人視網(wǎng)膜中SE的組織特異性和調(diào)控獨特性。

5、SE的TAD內(nèi)定位與靶基因的邊界絕緣和生物學(xué)功能有關(guān)

進一步研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)SE與桿狀細胞基因有關(guān)，反映了人類視網(wǎng)膜樣本中桿狀細胞的優(yōu)勢。研究還證明了SE靶基因的生物學(xué)功能可能與TAD中的SE定位以及TAD邊界絕緣有關(guān)。在TADs的邊緣，SEs的存在是與較弱的絕緣有關(guān)，與其他類型TAD相比，我們發(fā)現(xiàn)含SE的TAD中有更多的染色質(zhì)相互作用。值得注意的是，SE本身大多與位點的相互作用非常接近，表明在局部、TAD邊緣有很強的絕緣性，可能是由于CTCF結(jié)合的富集和避免附近基因的隨機激活，這與之前的研究一致。

SE靶向基因功能研究，即TSS與SE重疊或相互作用的基因，發(fā)現(xiàn)SE處在邊緣的TAD中都是富含應(yīng)激反應(yīng)基因，而視網(wǎng)膜基因主要在SE處于中心的TAD中富集，其中應(yīng)激反應(yīng)FOS重疊的SE位于TAD的邊緣，該TAD可能會受到超出自身TAD邊界的區(qū)域變化的影響。

6、染色質(zhì)loops、SEs和CREs與視網(wǎng)膜 eQTLs的聯(lián)合分析

eQTL將特定的遺傳變異與目標(biāo)基因表達的變化聯(lián)系起來（下文稱為eGene），為了識別可能與視網(wǎng)膜基因調(diào)節(jié)相關(guān)的eQTL，結(jié)合14,859個視網(wǎng)膜eQTLs，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)視網(wǎng)膜eQTL都存在于活躍的染色質(zhì)中，并駐留在同一個TAD中，這為解釋基因變體對eGene的影響提供了直接機制。此外，評估了變異與其eGene的啟動子區(qū)域（距離TSS±2.5kb）之間的物理距離，能夠區(qū)分啟動子eQTL、遠端eQTL和與啟動子相互作用的遠端eQTL。分別確定了2,410個CRE（CRE-eQTL）和880個SE（SE-eQTL）特殊的eQTL，其中58.5%的CRE-eQTL和69.3%的SE-eQTL也與相關(guān)的eGene相交?？傮w而言，大多數(shù)eQTL在物理上與eGene或其啟動子重疊或者通過染色質(zhì)loops互作接近各自的eGene。

7、基因組拓撲結(jié)構(gòu)將目標(biāo)基因與AMD和青光眼相關(guān)的風(fēng)險變異進行關(guān)聯(lián)

關(guān)于青光眼和AMD的GWAS研究已經(jīng)確定了大量的非編碼變異，包括eQTLs分析在內(nèi)的其他研究提供了進一步見解，但許多相關(guān)位點的目標(biāo)基因和變異仍然難以捉摸。研究人員將染色質(zhì)互作與從GWAS研究中識別的遺傳變異數(shù)據(jù)進行了整合，并對帶有GWAS先導(dǎo)和LD變體的成人視網(wǎng)膜基因組拓撲結(jié)構(gòu)進行了綜合分析，發(fā)現(xiàn)了幾個先前未知的可能與青光眼和AMD有關(guān)的基因。例如，研究展示了一個顯著的遠程相互作用導(dǎo)致目標(biāo)基因變化的青光眼相關(guān)基因TFAP2B/PKHD1。此外，小鼠中TFAP2B表達的中斷導(dǎo)致與青光眼一致的強烈病理表型，這些發(fā)現(xiàn)指向了與這些疾病相關(guān)的特定候選致病基因。研究團隊發(fā)現(xiàn)了AMD的候選致病基因，在CTRB2/CTRB1位點建立了CFDP1作為AMD相關(guān)的候選基因。

總結(jié)

研究團隊通過將高分辨率Hi-C數(shù)據(jù)與表觀遺傳圖譜和順式調(diào)控元件整合，為人類視網(wǎng)膜研究提供了一個重要的數(shù)據(jù)資源，促進了基因組調(diào)控的研究。研究團隊識別了視網(wǎng)膜病變中缺失的遺傳性，以及包括AMD和青光眼在內(nèi)的常見致盲疾病的候選因果基因和變異，該研究為將調(diào)控變異與視網(wǎng)膜疾病表型聯(lián)系起來提供了一個框架。整合的基因組調(diào)控圖譜還將有助于評估與其他常見視網(wǎng)膜相關(guān)疾病(如糖尿病視網(wǎng)膜病變)相關(guān)的基因，確定缺失的遺傳性，并了解遺傳性視網(wǎng)膜和黃斑疾病的基因型-表型相關(guān)性。

這項研究的首席研究員Anand Swaroop教授說:“這是視網(wǎng)膜調(diào)控基因組拓撲與老年性黃斑變性(AMD)和青光眼相關(guān)的遺傳變異的首次詳細整合，這兩種基因變異是視力喪失和失明的兩個主要原因?！盨waroop說:“擁有如此高分辨率的基因組結(jié)構(gòu)圖像，將繼續(xù)為組織特異性功能的基因控制提供見解?！?/p>

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