單細(xì)胞測(cè)序揭示擬南芥野生型和scr突變體根細(xì)胞的不同發(fā)育軌跡

明星基因SHR、SCR又發(fā)《Cell》子刊了？這到底是怎么一回事呢？今天的文獻(xiàn)分享就告訴您~

研究背景

多細(xì)胞生物通過控制的轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)明確細(xì)胞特性，關(guān)聯(lián)位置信息，協(xié)調(diào)器官的發(fā)育和成熟。明確這些網(wǎng)絡(luò)如何協(xié)調(diào)器官的發(fā)育和功能，需要詳細(xì)地理解該組織器官的時(shí)空基因表達(dá)模式。擬南芥的根是一個(gè)易于操作的模式器官，具有大多數(shù)細(xì)胞類型的標(biāo)記，以及形態(tài)學(xué)定義的發(fā)育階段。有利于進(jìn)行器官發(fā)育過程中的基因時(shí)空表達(dá)模式的研究。盡管，此前已有一些研究單位報(bào)道擬南芥單細(xì)胞測(cè)序圖譜，但是這些一代圖譜中沒有一個(gè)使用超過12,500個(gè)細(xì)胞。而且僅有一個(gè)研究單位推斷了三種以上細(xì)胞類型的發(fā)育進(jìn)程。因此，目前還沒有一個(gè)全面的擬南芥根系圖譜，可以捕捉到所有主要細(xì)胞類型的發(fā)育狀態(tài)的細(xì)微變化。

研究材料

材料：擬南芥野生型(?Col-0?)?96,000個(gè)根細(xì)胞(13個(gè)樣本)，scr突變體10,000個(gè)根細(xì)胞(n=2)，shr突變體10,000個(gè)根細(xì)胞(n=2)。

方法：?jiǎn)渭?xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、碘化丙啶（PI）染色

主要結(jié)果

1.?構(gòu)建擬南芥根的scRNA-seq圖譜，注釋細(xì)胞類型和發(fā)育階段

為了繪制一個(gè)全面的、器官尺度的擬南芥單細(xì)胞分辨率圖譜。作者選取5-7日齡的野生型幼苗主根尖0.5?cm的組織進(jìn)行取樣，制備原生質(zhì)體，使用10X?Genomics?scRNA-seq平臺(tái)對(duì)超過96,000個(gè)根細(xì)胞進(jìn)行了分析。之后結(jié)合已發(fā)表的scRNA-seq相關(guān)數(shù)據(jù)（3個(gè)樣本14,427個(gè)細(xì)胞），最終構(gòu)建了單細(xì)胞水平上的十萬級(jí)根細(xì)胞時(shí)空表達(dá)圖譜。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，每個(gè)細(xì)胞平均檢測(cè)出2,768個(gè)基因，總計(jì)24,997個(gè)基因，占擬南芥基因組中編碼基因的90%。作者推斷出jing q 的細(xì)胞類型注釋，將每個(gè)細(xì)胞分配到14個(gè)細(xì)胞類型和7個(gè)發(fā)育階段。之后，作者結(jié)合novoSpaRc、SEMITONES、ICI（index?of?cell?identity）等方法，通過每個(gè)細(xì)胞的表達(dá)譜來確定細(xì)胞類型和發(fā)育階段之間的邊界（圖1、圖2）。

2.?通過各個(gè)組織類型來推斷發(fā)育進(jìn)程

為了更詳細(xì)地分析根的各個(gè)細(xì)胞的發(fā)育進(jìn)程，作者從注釋的細(xì)胞系內(nèi)的簡(jiǎn)單擬時(shí)序分析開始，基于干細(xì)胞的起源將圖譜細(xì)分成4個(gè)組織/細(xì)胞系群。并使用兩種不同方法的非圖形工具CytoTRACE和scVelo來量化細(xì)胞的分化進(jìn)程。通過將擬時(shí)間順序劃分為10組（T0-T9）進(jìn)行差異表達(dá)分析，確定了基因的動(dòng)態(tài)表達(dá)隨著皮層和內(nèi)皮層的分化循序漸進(jìn)（圖3）。同樣，在中柱細(xì)胞、表皮、側(cè)根冠細(xì)胞（LRC）和中軸細(xì)胞之間，基因也呈現(xiàn)出重疊漸進(jìn)的表達(dá)模式。

3.理想傳輸理論確定發(fā)育軌跡

由于擬時(shí)序推理表明根細(xì)胞類型以不同的速率成熟，于是作者利用基于理想傳輸理論OT（Optimal?Transport）的StationaryOT分析方法來推斷整個(gè)圖譜的發(fā)育軌跡。研究人員發(fā)現(xiàn)它可以在很大程度上獨(dú)立于圖譜注釋和細(xì)胞系分割，來推斷細(xì)胞系的發(fā)育軌跡，反映每種細(xì)胞和組織類型分化的現(xiàn)有生物學(xué)知識(shí)。分化事件可以通過將多個(gè)命運(yùn)概率以“三角圖”的形式投影到重心坐標(biāo)中來實(shí)現(xiàn)可視化。作者利用“三角圖”分別展現(xiàn)了分生區(qū)、伸長(zhǎng)區(qū)、成熟區(qū)的內(nèi)皮層和皮層細(xì)胞的命運(yùn)概率（圖4D-F）。已知內(nèi)皮層標(biāo)記基因SCARECROW?(SCR)?和MYB36的表達(dá)模式與伴隨細(xì)胞成熟而不斷增加的內(nèi)皮層命運(yùn)概率相一致（圖4G）。之后按照發(fā)育區(qū)對(duì)生毛細(xì)胞、非生毛細(xì)胞（圖4J-L），中柱鞘、原形成層（圖4O-Q）也繪制“三角圖”。此外，理想傳輸理論也有助于識(shí)別發(fā)育調(diào)節(jié)因子。

4.scRNA-seq揭示scr突變體的分化途徑

在根的發(fā)育過程中，轉(zhuǎn)錄因子SHORTROOT?(SHR)?和SCR對(duì)干細(xì)胞龕維持和組織模式形成至關(guān)重要。那么，SHR或SCR的功能喪失會(huì)如何影響組織構(gòu)成以及根細(xì)胞的特性和分化呢？由于shr和scr突變體都缺乏形成基本組織的不對(duì)稱細(xì)胞分裂，導(dǎo)致形成了一個(gè)單一的突變體組織層，而不是皮層和內(nèi)皮層細(xì)胞層。與先前組織特異性標(biāo)記與形態(tài)檢測(cè)的突變體表型一致，通過對(duì)shr和scr突變體細(xì)胞的scRNA-seq數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，它們中表達(dá)內(nèi)皮層marker基因的細(xì)胞顯著減少。兩個(gè)突變體原生木質(zhì)部細(xì)胞的豐度也明顯下降了，并且shr中原生韌皮部和初生韌皮部細(xì)胞豐度下降，這與shr和scr中柱缺陷的表型一致。此外，該研究發(fā)現(xiàn)木質(zhì)部和韌皮部中柱鞘細(xì)胞（pericycle?cell）對(duì)應(yīng)的基因表達(dá)也下調(diào)了；這一結(jié)果與shr突變體影響側(cè)根發(fā)育一致（圖5）。

5.scRNA-seq表明scr突變層的轉(zhuǎn)分化

接下來，一個(gè)值得思考的問題是單一細(xì)胞是如何對(duì)報(bào)告的scr突變體層的混合特性做出貢獻(xiàn)的？從單一細(xì)胞的發(fā)育軌跡來說，造成這種混合特性的可能性有多種。1）細(xì)胞在發(fā)育早期獲得了內(nèi)皮層和皮層的身份，而突變層是將兩種細(xì)胞類型的異質(zhì)性混合；2）每個(gè)細(xì)胞可能具有皮層和內(nèi)皮層的混合屬性；3）細(xì)胞在發(fā)育早期只獲得一種特性，隨后改變其命運(yùn)。通過StationaryOT分析來計(jì)算scr細(xì)胞的命運(yùn)概率最終發(fā)現(xiàn)scr突變層細(xì)胞同時(shí)具有皮層和內(nèi)皮層的特性。有意思的是，scr突變層細(xì)胞在發(fā)育早期（分生區(qū)）主要是類似皮層，而成熟區(qū)的細(xì)胞呈現(xiàn)出內(nèi)皮層的特性（圖6-1）。

為了在體內(nèi)進(jìn)一步對(duì)scRNA-seq得到的結(jié)論進(jìn)行驗(yàn)證，作者驗(yàn)證了皮層和內(nèi)皮層標(biāo)志物的空間表達(dá)模式在scr突變層是否會(huì)發(fā)生改變。在WT中，內(nèi)皮層標(biāo)志基因MYB36和皮層轉(zhuǎn)錄報(bào)告基因AT1G09750?(CORTEX)在它們各自類型的伸長(zhǎng)區(qū)表達(dá)，MYB36在分生區(qū)的內(nèi)皮層也表達(dá)。但scr突變體中，MYB36轉(zhuǎn)錄報(bào)告基因的表達(dá)僅在晚期延伸區(qū)和成熟區(qū)可見，皮層轉(zhuǎn)錄報(bào)告基因在延伸區(qū)和成熟區(qū)都有所減少（圖6-2）。以上結(jié)果都與scRNA-seq分析結(jié)果一致。

總結(jié)

這篇文章通過對(duì)不同發(fā)育階段的擬南芥根細(xì)胞進(jìn)行scRNA-seq，構(gòu)建了十萬級(jí)水平的根細(xì)胞基因時(shí)空表達(dá)圖譜，并利用理想傳輸理論（OT）推斷出了細(xì)胞系的發(fā)育軌跡。同時(shí)，通過比較scr和shr突變體的scRNA-seq數(shù)據(jù)，從單細(xì)胞水平闡釋了scr突變層細(xì)胞同時(shí)具有皮層和內(nèi)皮層混合特性，并指出了其發(fā)育軌跡上的特性轉(zhuǎn)變。最后，使用內(nèi)皮層和皮層轉(zhuǎn)錄報(bào)告基因?qū)σ陨辖Y(jié)論進(jìn)行了體內(nèi)驗(yàn)證。

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