單細胞轉錄組測序在肝癌應用思路及項目經驗中的應用

肝臟在人類生理中起著至關重要的作用，其具有獨特的再生能力可以修復急性損傷以維持其正常生理功能。然而肝功能障礙可能導致多種危及生命的疾病，肝癌是全球癌癥死亡率第二高的癌癥，在我國發(fā)病率和死亡率分別位居第四位和第三位。肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）最為常見，占原發(fā)性肝癌的70％~90％。肝癌的治療失敗、耐藥性和高死亡率與惡性細胞的異質性以及復雜的腫瘤微環(huán)境（TME）密切相關。因此，了解肝癌的細胞圖譜和分子組成，對于腫瘤生物學研究和開發(fā)新的治療策略至關重要。單細胞測序是研究腫瘤微環(huán)境中細胞成分及其相互作用的有力工具，已被廣泛應用于大量腫瘤異質性研究。目前，單細胞測序技術已經為肝癌腫瘤微環(huán)境、腫瘤發(fā)生發(fā)展機制、克隆進化、免疫治療等方面提供了深入見解。

下面小編將從研究進展、應用方向、百邁客項目經驗三個方面分別進行介紹，總結出單細胞轉錄組測序技術在肝癌中的代表性文章，希望為各位老師提供一些新的研究思路。

研究進展

單細胞測序技術自2009年問世以來，在研究人員和臨床醫(yī)生中越來越受歡迎。與bulkRNA-seq相比，scRNA-seq最顯著的優(yōu)勢在于對腫瘤異質性的詳細描述，包括HCC在內的許多惡性腫瘤的棘手問題。scRNA-seq繪制了單個肝癌細胞的基因表達圖譜，并確定了容易被忽視的耐藥亞群的特征，尤其是在CSC中。腫瘤間異質性（ITH）阻礙了HCC治療結果的改善。同時，scRNA-seq通過繪制免疫細胞的綜合景觀來實現(xiàn)腫瘤免疫。對于HCC患者，T細胞、B細胞、NK細胞、TAM和DC已被鑒定并具有特征基因。幾種新發(fā)現(xiàn)的細胞亞型，例如MAIT，DPT細胞和LAMP3+ DCs可能為開發(fā)新的靶向免疫療法帶來新思路。此外，腫瘤免疫微環(huán)境不是靜止的，單細胞分析有助于揭示多種免疫細胞亞型的起源和動態(tài)轉變。在各種腫瘤浸潤淋巴細胞和骨髓細胞中，CD8+T細胞的發(fā)育軌跡已得到充分研究。結合scRNA-seq、單細胞TCR測序分析可能有助于評估新抗原特異性、細胞毒性和異質T細胞亞群的進化連通性。此外，針對生物事件的治療有利于CTC存活，例如EMT和Treg募集，在控制HCC血源性轉移和肝移植受者復發(fā)方面顯示出巨大潛力。通過scRNA-seq除了鑒定肝癌惡性和非惡性細胞、細胞亞群和/生物標志物深入剖析HCC異質性，也可以為個體化聯(lián)合治療提供理論依據(jù)。^【1】

應用方向

1、繪制肝癌異質性圖譜

案例1、單細胞轉錄組測序揭示了HBV相關肝細胞癌的免疫抑制圖譜和腫瘤異質性^【2】

標題：Single-cell RNA sequencing shows the immunosuppressive landscape and tumor heterogeneity of HBV-associated hepatocellular carcinoma

期刊名稱：Nat Commun

影響因子：12.121

發(fā)表日期：2021年6月

樣本設計：8例HCC患者的腫瘤組織

研究內容：本研究通對HBV 相關人類肝細胞癌 (HCC) 患者進行單細胞測序，研究發(fā)現(xiàn)腫瘤相關巨噬細胞抑制腫瘤 T 細胞浸潤，Treg細胞又會進一步使腫瘤浸潤性 T 細胞和 NK 細胞因行使天然的腫瘤免疫功能進一步處于耗竭狀態(tài)。此外，研究發(fā)現(xiàn)，TIGIT-NECTIN2 相互作用調節(jié)免疫抑制環(huán)境，在HCC 小鼠模型中敲除敲低Nectin2會持續(xù)誘發(fā)腫瘤變小、恢復 T 細胞浸潤并減少T 細胞耗竭，進一步證明TIGIT-NECTIN2靶向治療HCC的潛力。

案例2、單細胞轉錄組學揭示了肝癌中腫瘤內異質性和干細胞相關亞群的圖譜^【3】

標題：Single-cell transcriptomics reveals the landscape of intra-tumoral heterogeneity and stemness-related subpopulations in liver cancer

期刊名稱：Cancer Lett

影響因子：7.36

發(fā)表日期：2019年6月

研究內容：根據(jù)EPCAM表達，HCC 單細胞顯示出兩個不同的主要細胞群。在EPCAM +細胞群中多個癌基因表達上調，另外EPCAM +細胞群中還存在一個CD24 + /CD44 +的稀有細胞亞群，可能是新的干細胞相關亞型，CTSE是該群細胞中上調最多的特征基因。敲除CTSE顯著降低了體外腫瘤細胞的自我更新能力和體內致瘤性能力， CTSE的干性作用通過裸鼠體內致瘤性測定得到進一步證實。研究表明單細胞基因組是描繪 HCC 腫瘤異質性的有利工具，可以鑒定到稀有的細胞亞群，長遠來看能更好的指導精準醫(yī)療。

案例3、單細胞測序揭示肝癌免疫微環(huán)境的動態(tài)特征^【4】

標題：Landscape and Dynamics of Single Immune Cells in Hepatocellular Carcinoma

期刊名稱：cell

影響因子：38.637

發(fā)表日期：2019年8月

樣本設計：16例肝癌（HCC）患者癌、癌旁、淋巴結、血液和腹水樣本，分選CD45+細胞

研究內容：本研究發(fā)現(xiàn)免疫細胞類型表現(xiàn)出不同的組織偏好性，T 細胞中，包含調節(jié)型 T 細胞、耗竭型CD8+ T細胞和增殖型 T 細胞，主要在腫瘤中富集，髓系細胞主要在腹水中富集。腹水是肝癌患者常見的病理現(xiàn)象，其產生與肝癌預后不良有關，然而腹水中的免疫細胞組成及其與肝癌的聯(lián)系尚不清楚。研究者為了探究腹水中細胞的潛在起源，將腹水的免疫細胞與其他組織細胞進行比對分析，發(fā)現(xiàn)腹水中的淋巴細胞和髓系細胞來源明顯不同，淋巴細胞主要映射到血液、腫瘤和鄰近肝臟中，而髓系細胞主要定位于腫瘤組織?；诰€粒體突變的譜系追蹤結果顯示，腫瘤組織和腹水中的細胞具有共同譜系。隨后作者研究了腹水和其他組織中巨噬細胞的關系，發(fā)現(xiàn)巨噬細胞存在從腫瘤到腹水遷移的過程。作者對不同組織部位的免疫細胞進行綜合表征分析，探究了免疫細胞在癌癥環(huán)境中的動態(tài)特性，從而揭示TME、LN和腹水中髓系細胞和淋巴細胞的差異譜系和遷移關系。

案例4、腫瘤細胞生物多樣性驅動肝癌微環(huán)境重編程^【5】

標題：Tumor Cell Biodiversity Drives Microenvironmental Reprogramming in Liver Cancer

期刊名稱：Cancer Cell

影響因子：26.604

發(fā)表日期：2019年12月

樣本設計：9例肝癌（HCC）患者和10例肝內膽管癌（iCCA）患者

研究內容：本文構建了19名HCC和iCCA患者的單細胞轉錄組圖譜，并開發(fā)了一種測量與預后相關的 ITH 程度的方法。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤內和腫瘤間的惡性細胞以及腫瘤微環(huán)境存在不同程度的異質性。VEGFA 對CAF、TAM和TECs具有特異性，對T細胞不具有特異性，同時，VEGFA主要在惡性細胞中表達。VEGFA是缺氧誘導因子 1-α (HIF1A) 的直接靶標，HIF1A 是感知缺氧的關鍵因素，缺氧可直接誘導HIF1A轉錄及其蛋白水平，從而激活其下游的缺氧信號。表明惡性細胞VEGF 表達與 TME 重編程有關，從而促進有利于腫瘤進展的免疫抑制環(huán)境。此研究表明，測量腫瘤細胞的生物多樣性可能是一種可行的方法，可以確定腫瘤進化的共同特征，以預測肝臟腫瘤的侵襲性。研究為免疫檢查點抑制劑和抗 VEGF 的聯(lián)合治療以提高治療效果提供了基本原理。

2、肝癌發(fā)生發(fā)展機制（腫瘤-免疫循環(huán)系統(tǒng)）

案例5、先天淋巴細胞ILC2通過 CXCL2-中性粒細胞誘導的免疫抑制促進 HCC 進展^【6】

標題：Group-2 Innate Lymphoid Cells Promote HCC Progression Through CXCL2-Neutrophil-Induced Immunosuppression.

期刊名稱：Hepatology

影響因子：14.679

發(fā)表日期：2021年11月

樣本設計：1個HCC患者及正常肝臟樣本，分選LIN-造血細胞用于單細胞測序

研究內容：固有淋巴細胞已經在不同類型的腫瘤中被鑒定到，它是一類沒有重組抗原特異性的先天免疫細胞，主要分為ILC1、ILC2和ILC3家族。目前研究較多的ILC2因其沒有T細胞和B細胞接受體，因此其功能以上下游依賴的方式變化，盡管在一些肝臟疾病中有被研究，但ILCs在肝癌中的具體角色并不清楚。此文章中作者通過FACS和scRNA技術發(fā)現(xiàn)了ILCs在HCC病人中顯著的富集，并且和腫瘤的反復、整體的生存率都有關系。通過流式細胞儀鑒定到了一群HCC產生的ILC2s，它們的殺傷細胞凝集素樣亞家族G成員1表達降低，同時腫瘤細胞里E-鈣粘蛋白的減少會進一步減少KLRG1 ，此外KLRG1-ILC2顯示趨化因子的產生增加，包括C-X-C基序趨化因子（C-X-C基序）配體（CXCL）-2和CXCL8，它們反過來招募中性粒細胞形成免疫抑制劑，導致腫瘤惡化。因此，在小鼠肝癌模型中，恢復ILC2s中的KLRG1、抑制ILC2s中的CXCL2或耗盡中性粒細胞可抑制腫瘤進展，總體表明HCC相關的ILC2s是一種促進腫瘤發(fā)展的免疫調節(jié)細胞類型，靶向這些ILC2s可能催生HCC的新療法。

案例6、肝癌中的肝星狀細胞通過產生生長分化因子15促進腫瘤生長^【7】

標題：Hepatic Stellate Cells in Hepatocellular Carcinoma Promote Tumor Growth Via Growth Differentiation Factor 15 Production

期刊名稱：Gastroenterology

影響因子：17.373

發(fā)表日期：2020年12月

樣本設計：12例HCC患者腫瘤組織和非腫瘤組織

研究內容：大部分的HCC由肝纖維化發(fā)展而來，而HSCs則作為成纖維細胞產生大量的基質蛋白，在肝纖維化中扮演了重要的角色。本文中作者通過對HSC特異性缺陷的Atg-7和生長分化因子缺陷的（GDF-15）小鼠進行鏈脲霉素處理高脂飲食。同時做了LX-2 HSC細胞系和人腫瘤細胞混合培養(yǎng)。通過單細胞測序發(fā)現(xiàn)，小鼠模型中，GFAP-Atg7KO比野生型小鼠的腫瘤數(shù)量少并且小。LX-2和肝癌細胞的混合培養(yǎng)中，LX-2的細胞自噬被促進，Atg7-KO則能減弱LX-2細胞自噬和肝癌細胞生長，同時Atg7-KO可減弱LX-2細胞自噬和肝癌細胞生長也出現(xiàn)了同樣的現(xiàn)象。RNA測序發(fā)現(xiàn)LX-2和HepG2共培養(yǎng)后GDF15表達增加，GDF15KO的LX-2細胞系沒有發(fā)現(xiàn)癌癥細胞的促進增殖，在脂肪肝炎的模型中，GDF15的缺乏會減少腫瘤的大小。綜上所述在HCC微環(huán)境中，以自噬依賴方式產生GDF15的HSC可能與腫瘤發(fā)生有關。

3、預后標志物及治療靶點開發(fā)

案例7、肝癌內皮細胞重編程促進免疫抑制性巨噬細胞的產生^【8】

標題：Onco-fetal Reprogramming of Endothelial Cells Drives Immunosuppressive Macrophages in Hepatocellular Carcinoma

期刊名稱：cell

影響因子：38.637

發(fā)表日期：2020年10月

樣本設計：14名HCC患者（5 名 HepB -和 9 名 HepB +）及1例健康捐贈者的肝臟樣本，估計胎齡 (EGA) 為16 周和 21 周的胎兒肝臟樣本

研究內容：眾所周知，腫瘤細胞能夠概括早期胎兒發(fā)育的特征，包括獲得干細胞樣特征、EMT（上皮-間質轉化）和癌胎蛋白的表達。研究繪制了人類肝臟從胚胎發(fā)育到肝癌細胞的單細胞圖譜，發(fā)現(xiàn)肝細胞癌腫瘤微環(huán)境具有明顯的胚胎樣重編程特征，并在跨物種比較分析中發(fā)現(xiàn)小鼠胚胎，胚胎肝臟以及腫瘤巨噬細胞之間存在顯著的相似性，表明胚胎肝臟發(fā)育與HCC生態(tài)系統(tǒng)之間存在一個共享程序，即胎-瘤重編程。同時，研究揭示了VEGF/NOTCH信號在維持HCC免疫抑制的胎-瘤生態(tài)系統(tǒng)中的重要作用。VEGF/NOTCH介導的免疫抑制胎-瘤系統(tǒng)的概念不僅為癌癥治療干預提供了新的靶點，而且還可以作為潛在的生物標志物用于計劃使用免疫治療的HCC患者，研究也為鑒定和理解其他癌癥中的類似機制開辟了道路。

案例8、單細胞測序揭示早期復發(fā)肝癌特征性免疫圖譜^【9】

標題：Single-cell Landscape of the Ecosystem in Early-relapse Hepatocellular Carcinoma

期刊名稱：cell

影響因子：38.637

發(fā)表日期：2021年1月

樣本設計：12例原發(fā)肝癌和6例早期復發(fā)肝癌患者的腫瘤組織和癌旁組織，進行全長單細胞轉錄組測序，并采用2個獨立的隊列（第1隊列，4例患者的配對原發(fā)腫瘤和復發(fā)腫瘤；第2隊列，47例患者的配對原發(fā)腫瘤和復發(fā)腫瘤）對相關結果進行驗證（見下圖）。

研究內容：本文構建了12例原發(fā)性肝細胞癌患者和6例早期復發(fā)肝細胞癌患者癌和癌旁的單細胞圖譜，發(fā)現(xiàn)與原發(fā)性肝癌微環(huán)境相比，復發(fā)性肝癌呈現(xiàn)獨特的免疫生態(tài)系統(tǒng)，即DC比例增加，Tregs減少，T細胞增殖減少，CD8+T細胞豐度更高。通過整合TCR克隆和Monocle分析，研究者確定了CD8+T細胞的分化路徑。PT和RT樣本中CD8+T細胞表現(xiàn)出相同的分化軌跡，但表現(xiàn)出明顯不同的免疫和轉錄狀態(tài)，與原發(fā)性肝癌樣本（PT）相比，早期復發(fā)性肝癌樣本（RT）中的CD8+T細胞耗竭信號的表達減少，表達免疫檢查點基因的細胞比例減少，組織駐留基因增加，而共刺激和耗竭分子減少。同時，研究者發(fā)現(xiàn)免疫檢查點基因CTLA4、HAVCR2和TIGIT在復發(fā)腫瘤的T細胞中表達降低，這表明針對這些標志物的檢查點阻斷方法可能對原發(fā)性肝癌有效，但對復發(fā)患者無效。綜上所述，治療原發(fā)性或復發(fā)性肝癌需要不同的治療方法。

案例9、FABP5作為人肝細胞癌免疫代謝標志物的鑒定^【10】

標題：Identification of FABP5 as an immunometabolic marker in human hepatocellular carcinoma

期刊名稱：J Immunother Cancer

影響因子：9.913

發(fā)表日期：2020年7月

樣本設計：20名HCC患者癌和癌旁樣本，分選T細胞

研究內容：本文從HCC患者中分離CD3+CD45+T細胞并進行單細胞轉錄組測序，分析結果表明，腫瘤組織中存在多個耗盡的T細胞（Tex）群體，CD137 可識別并豐富 Tex，具有卓越的效應功能和增殖能力，這群細胞表達FABP5以及線粒體氧化代謝作用增強。抑制 FABP5 表達和線粒體脂肪酸氧化會損害富含 CD137 的 Tex 的抗細胞凋亡和增殖，這些觀察結果已通過生成CD137 CART得到驗證。118 例 HCC 患者的組織微陣列免疫組織化學染色顯示腫瘤內 FABP5高CD8 +T 細胞浸潤與總生存期和無復發(fā)生存期有關。118例HCC患者的組織微陣列免疫組織化學染色顯示，腫瘤內FABP5高CD8+T細胞與總生存率和無復發(fā)生存率相關。結果表明，腫瘤微環(huán)境可以對 T 細胞功能施加代謝限制。CD137 是一種在某些 Tex 上高度表達的共刺激分子，它利用外源脂肪酸和氧化代謝來介導抗腫瘤免疫。免疫代謝標志物 FABP5 應在更大的縱向研究中進行研究，以確定它們作為 HCC預后生物標志物的潛力。

4、解析腫瘤耐藥機制

案例10、晚期肝癌患者受益于派姆單抗：結果來自單臂 2 期試驗^【11】

標題：Hepatocellular carcinoma patients with high circulating cytotoxic T cells and intra-tumoral immune signature benefit from pembrolizumab: results from a single-arm phase 2 trial

期刊名稱：Genome Medicine

影響因子：10.675

發(fā)表日期：2021年4月

樣本設計：10名BLCL-C期患者派姆單抗治療前后的PBMC樣本

研究內容：本文對索拉非尼治療失敗后接受派姆單抗治療的HCC患者的pbmc進行單細胞轉錄組測序，研究表明派姆單抗在索拉非尼治療失敗后總體緩解率為10%。在使用臨床病理學特征的單變量分析中，女性、PD-L1 陽性和低中性粒細胞與淋巴細胞比 (NLR) 被確定為派姆單抗反應的促成因素。CTNNB1 的體細胞突變和 MET 的基因組擴增僅在無應答者中發(fā)現(xiàn)。通過 RNA 測序的轉錄譜確定，pembrolizumab 應答者表現(xiàn)出 T 細胞受體 (TCR) 信號激活與 MHC 基因的表達，表明 T 細胞細胞毒性水平增加。在對 10 個治療前和治療后外周血單個核細胞 (PBMC) 進行單細胞測序時，獲得部分緩解或疾病穩(wěn)定的患者表現(xiàn)出向細胞毒性 CD8+ T 細胞的免疫轉變。綜上，具有細胞毒性 T 細胞浸潤的 HCC 患者，以及活躍循環(huán) CD8+ T 細胞的增加和中性粒細胞相關標志物的下調，顯著受益于派姆單抗治療。

百邁客項目經驗

肝臟是人體代謝和解讀的器官，在體內發(fā)揮氧化、儲存肝糖、合成分泌性蛋白合成等，肝臟也制造消化系統(tǒng)中之膽汁，人肝約有25億個肝細胞。但是解離肝臟組織懸液并不簡單，首先，肝臟代謝旺盛，離體后肝細胞無法進行正常的有氧糖酵解，細胞活力會迅速下降，另外，肝細胞的線粒體很多，每個細胞大約有1000個左右，遍布于胞質內。因此，很難得到符合單細胞測序要求的單細胞懸液。百邁客生物在肝臟組織單細胞懸液制備方面有豐度的實操經驗，開發(fā)了獨有的解離體系，下面來看實驗結果：

實驗結果

Tips: 肝實質細胞經過解離后因為缺氧非常容易發(fā)生凋亡，導致占比很低，如果老師關注肝實質細胞的話，建議采用單細胞核懸液的方法。

 

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