單細(xì)胞測序揭示慢性淋巴細(xì)胞白血病的免疫抑制機(jī)制

研究背景

慢性淋巴細(xì)胞白血?。–LL）會導(dǎo)致患者機(jī)體感染易感性增加，但并非均與T細(xì)胞功能障礙有關(guān)，因此，識別具有T細(xì)胞缺陷的CLL患者非常重要。前期研究已證明基因BCL-2在CLL中具有重要作用，但尚無研究證明其在CLL患者T細(xì)胞中的作用。本研究確定了BCL-2在CLL腫瘤微環(huán)境中T細(xì)胞中的調(diào)節(jié)作用。

研究材料

材料：6名CLL患者和2名健康人的血液樣本，臨床信息如下

方法：單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序

研究成果

1、CD4+ T細(xì)胞中BCL-2的表達(dá)與Treg的激活和增殖有關(guān)

單細(xì)胞測序共得到16個(gè)細(xì)胞群，其中cluster6被鑒定為CD4+ T細(xì)胞（圖1a）。使用limma包分析BCL2陽性和陰性細(xì)胞中的基因表達(dá)，并使用熱圖和火山圖繪制差異表達(dá)基因（DEG）（圖1b，c）。KEGG富集分析表明，DEGs主要富集與“細(xì)胞粘附”相關(guān)的信號通路，包括“細(xì)胞-細(xì)胞粘附的調(diào)節(jié)”和“白細(xì)胞-細(xì)胞粘附的調(diào)節(jié)”，除此以外還包括“T 細(xì)胞活化”（圖1d）。

DEG的GSEA表明BCL2+?T細(xì)胞的Treg數(shù)量增加。此外，BCL2+?T細(xì)胞中的Treg多于BCL2-?T細(xì)胞（圖2e，f）。GSVA分析顯示BCL2+?T細(xì)胞具有“IL-6相關(guān)特征”和“T細(xì)胞激活相關(guān)特征”（圖2g）。GSEA分析觀察到BCL2+?T細(xì)胞主要參與EGFR/MEK信號通路（圖2h）。最后，分析了BCL2+?T細(xì)胞的代謝特征，發(fā)現(xiàn)BCL2+?T細(xì)胞可能與“缺氧抑制因子（HIF）調(diào)節(jié)基因”和“糖原代謝基因”有關(guān)（圖2i）。

2、CD8+?T細(xì)胞中的BCL2表達(dá)與細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞耗竭增加有關(guān)

Cluster 8被鑒定為CD8+?T細(xì)胞，比較了BCL2陽性和陰性CD8+?T細(xì)胞之間的基因表達(dá)（圖3a-c）。KEGG富集分析表明，DEG富集在T細(xì)胞活化和細(xì)胞-細(xì)胞粘附相關(guān)的信號通路上，并且BCL2在CD8+?T細(xì)胞中的表達(dá)可能與細(xì)胞遷移、細(xì)胞毒性有關(guān)（圖3d）。 CD8+?T細(xì)胞中的BCL2表達(dá)顯示出T細(xì)胞衰竭特征。發(fā)現(xiàn)BCL2+?T細(xì)胞中耗竭CD8+ T細(xì)胞的數(shù)量顯著增加，表明BCL2+?CD8+?T細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄譜與耗竭T細(xì)胞相似（圖3e，f）。TF預(yù)測分析與CD4+?T細(xì)胞結(jié)果相似，這表明CD4+和CD8+ T細(xì)胞可能共享相同的上游信號通路（圖3g）。代謝特征分析發(fā)現(xiàn)HIF調(diào)節(jié)基因和磷酸戊糖途徑基因與BCL2+?CD8細(xì)胞相關(guān)（圖3h）。

3、BCL-2表達(dá)與CLL患者的Th1降低和Treg升高有關(guān)

收集了70名CLL患者的PBMC樣本。首先，在T細(xì)胞中檢測BCL-2表達(dá)，包括T1、T2、T17、T22、Tregs和濾泡輔助T細(xì)胞（Tfh），發(fā)現(xiàn)BCL-2+的T1細(xì)胞百分比顯著降低（圖4a）；T2、T17、T22和Tfh細(xì)胞顯著升高（圖4b-e），T細(xì)胞中BCL-2表達(dá)對Tregs的影響較大（圖4f）。研究發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞中的BCL-2表達(dá)可以影響T亞群。

4、BCL-2+?CD4+ Treg中IL-10和TGF-β上調(diào)

TGF-β在幼稚CD4+細(xì)胞分化為Treg的過程中至關(guān)重要，對于維持Treg穩(wěn)態(tài)也很重要。研究發(fā)現(xiàn)與BCL-2-Treg相比，BCL-2+ Treg中IL-10和TGF-β的MFI顯著增加（圖5a-d），然而IL-35+和TGF-β+沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而BCL-2+ Tregs可以分泌更多的IL- 35和TGF-β（圖5d，f）。

5、BCL-2促進(jìn)CLL患者的細(xì)胞耗竭并降低CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒性

在70名CLL患者中研究了CD8+ T細(xì)胞BCL-2表達(dá)與其耗竭和細(xì)胞毒性之間的關(guān)聯(lián)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BCL-2+細(xì)胞中耗竭CD8+T細(xì)胞的比例和MFI顯著高于BCL-2-T細(xì)胞（圖6a，b）。 除了導(dǎo)致T細(xì)胞耗竭之外，BCL-2表達(dá)增加與顆粒酶B和穿孔素的表達(dá)減少有關(guān)。此外，CD8+ BCL-2+ T細(xì)胞中顆粒酶B陽性的百分比降低，而穿孔素在CD8 +BCL-2+ T細(xì)胞保持不變，但CD8+BCL-2+ T細(xì)胞中顆粒酶B和穿孔素的MFI水平高于CD8+BCL-2-T細(xì)胞（圖6c-f）。

6、BCL-2改變CLL患者的T細(xì)胞分化

一般來說，T細(xì)胞的分化根據(jù)CD45RA和CD62L的表達(dá)可分為四個(gè)階段，幼稚T細(xì)胞（Tn、CD45RA+CD62L+）、效應(yīng)T細(xì)胞（Tef、CD45RA+CD62L-）、效應(yīng)記憶T細(xì)胞 （Tem，CD45RA-CD62L-）和中央記憶T細(xì)胞（Tcm，CD45RA-CD62L+）（圖7a，b）。對每個(gè)T細(xì)胞亞群中BCL-2的表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果表明BCL-2+ T細(xì)胞中幼稚T細(xì)胞的比例高于BCL-2- T細(xì)胞（圖7c，d）。此外，BCL-2+ T細(xì)胞中Tem和Tcm的比例低于BCL-2- T細(xì)胞。

7、CR患者中BCL-2+ T細(xì)胞的頻率和恢復(fù)功能降低

比較了來自12名匹配的venetoclax治療前后的CLL患者外周T細(xì)胞的BCL-2表達(dá)和功能（圖8a-e），發(fā)現(xiàn)venetoclax顯著降低了CLL患者中CD4+BCL-2+和CD8+BCL-2+ T細(xì)胞的占比（圖8f，g）。 此外，venetoclax處理后，CD4+ T細(xì)胞中Tregs和CD8+ T細(xì)胞中PD1+Tim-3+細(xì)胞的百分比顯著降低（圖8h，i）。這些結(jié)果表明，外周T細(xì)胞中BCL-2的表達(dá)是預(yù)測治療反應(yīng)的潛在指標(biāo)。

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研究結(jié)論

本研究揭示了BCL-2在CLL患者T細(xì)胞中的作用，發(fā)現(xiàn)BCL-2通過增強(qiáng)Treg分化和CTL細(xì)胞耗竭來促進(jìn)免疫抑制。研究還確定了使用BCL-2抑制劑venetoclax治療CLL的新策略，并為恢復(fù)T細(xì)胞功能提供了新的思路。

 

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