韓永超博士團隊發(fā)現(xiàn)DMI類殺菌劑對炭疽菌無性繁殖的促進作用

研究背景

由真菌侵染引起的作物病害每年在全世界造成約20%的產(chǎn)量損失，收獲后還會造成10%的損失。真菌對人類健康的影響目前呈螺旋上升趨勢，真菌疾病的全球死亡率現(xiàn)已超過瘧疾或乳腺癌，與結(jié)核病和艾滋病毒的死亡率相當。化學防治是控制引起作物和動物疾病的真菌病原體的最重要措施之一。然而，隨著殺菌劑的廣泛使用，出現(xiàn)了許多問題，其中最重要的是真菌耐藥性和殺菌劑殘留。目前，對于植物病原體而言，許多地區(qū)的白粉病、紋枯病、鐮刀菌穗枯病和小麥赤霉病對常用殺菌劑的抗性頻率已導致化學防治效果的下降或失敗。在人類中，高?；颊唛L期的預防性治療同樣會導致真菌耐藥性的出現(xiàn)。為了提高防治效果，農(nóng)民盲目提高施用頻率或不加區(qū)別地使用各種登記范圍外農(nóng)藥，這是我國農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染的主要來源。關于施用后殺菌劑的影響，之前的研究主要集中在農(nóng)藥殘留對水果和蔬菜的有害影響；殺菌劑在處理后的殘留,尤其是它們在目標真菌生長和產(chǎn)孢中的潛在作用很少受到關注。

草莓炭疽病是一種嚴重危害草莓生產(chǎn)的真菌病害，炭疽病的防治主要依靠化學殺菌劑。殺菌劑，尤其是甾醇C-14α-脫甲基酶抑制劑（DMIs）和線粒體呼吸抑制劑（QoI）廣泛應用于草莓炭疽病和其它植物真菌病害的防治。本研究旨在以炭疽菌和DMIs為模型，更好地了解低劑量殺菌劑殘留對真菌產(chǎn)孢的作用，并希望在劑量和時間方面制定最*殺菌劑控制策略。作者對低劑量殺菌劑脅迫下的炭疽菌進行了形態(tài)學和轉(zhuǎn)錄組學分析。

實驗材料與方法

1、炭疽菌菌株：從發(fā)病草莓和山藥組織中分離鑒定出108個炭疽菌菌株（Colletotrichum spp.），這些菌株分為5個種，其中89個C. siamense, 7 個C. fructicola, 5 個C. gloeosporioides,?4個C. aenigma和3個C. nymphaeae菌株。

2、殺菌劑：兩種DMI類殺菌劑：苯醚甲環(huán)唑（95.0%）和咪鮮胺（97.0%），一種QoI類殺菌劑：吡唑醚菌酯（98.3%）。

3、炭疽菌對殺菌劑脅迫的形態(tài)學響應：觀察108個炭疽菌菌株在含有不同種類和濃度殺菌劑的PDA培養(yǎng)基中生長時的形態(tài)，記錄不同處理條件下各菌株的產(chǎn)孢情況。

4、從5種炭疽菌中選取20個代表性菌株評估殺菌劑脅迫對分生孢子產(chǎn)量的影響：包括 5個C. siamense, 4個C.?gloeosporioides, 4個C. fructicola, 4個C. aenigma和3個C. nymphaeae。

5、DMI對炭疽菌在植株組織上產(chǎn)孢的影響：用C. fructicola?菌株Gwha-1接種不同濃度苯醚甲環(huán)唑處理的草莓葉片，分析植物組織上分生孢子數(shù)量的變化趨勢。

6、轉(zhuǎn)錄組分析材料：用C. fructicola 菌株Gwha-1菌絲體做轉(zhuǎn)錄組，實驗組：添加0.1593 μg/ml苯醚甲環(huán)唑的PDA培養(yǎng)基，對照組未添加任何殺菌劑，于28°C下黑暗條件下培養(yǎng)3天，每組取3個生物學重復樣。

主要結(jié)果與分析

1、炭疽菌對殺菌劑脅迫的形態(tài)學響應

對108個炭疽菌菌株的形態(tài)觀察過程中發(fā)現(xiàn)：在未添加任何殺菌劑PDA上于28°C黑暗中培養(yǎng)5天期間，除兩個C. nymphaeae菌株外，所有菌株的菌落顏色均未出現(xiàn)明顯變化。培養(yǎng)5天后，兩個C. nymphaeae菌株在PDA上產(chǎn)生肉眼可見的透明粉紅色菌落。苯醚甲環(huán)唑和咪鮮胺能夠促進炭疽菌菌株的無性繁殖。隨著苯醚甲環(huán)唑或咪鮮胺濃度的增加，更多的菌株表現(xiàn)出菌落顏色的變化，表明產(chǎn)生了更多的分生孢子。在含有7.9667μg ml^-1苯醚甲環(huán)唑或0.8080μg ml^-1咪鮮胺的PDA上，分別有85和83株炭疽菌產(chǎn)生粉紅色菌落，表明分生孢子產(chǎn)量增加。然而，吡唑醚菌酯對炭疽菌在PDA上的產(chǎn)孢沒有顯著影響。說明不同種類殺菌劑對炭疽菌產(chǎn)孢的影響存在差異，DMI類殺菌劑對炭疽菌產(chǎn)孢的促進作用并不局限于某個種類的炭疽菌或某幾個菌株，這種促進作用在炭疽菌中廣泛存在。

2.苯醚甲環(huán)唑?qū)μ烤揖诓葺~片上產(chǎn)孢的影響

在接種后的前12天或16天C. fructicola在草莓葉片上的產(chǎn)孢量逐漸增加，然后下降。在接種初期（第4天和第8天），苯醚甲環(huán)唑抑制了C. fructicola的生長，導致分生孢子產(chǎn)量低于未經(jīng)處理的對照。在接種后4天和8天時，7.9667 μg ml^-1苯醚甲環(huán)唑處理的分生孢子產(chǎn)量顯著低于對照。苯醚甲環(huán)唑濃度為0.0319 μg ml^-1、8 dai時的分生孢子產(chǎn)量也顯著低于對照組。然而，在接種后12天和16天時，苯醚甲環(huán)唑處理的葉片上的分生孢子產(chǎn)量顯著高于未處理的對照?？偟膩碚f，苯醚甲環(huán)唑處理過的葉片在0.0319 lg ml^-1和7.9667 μg ml^-1下的最高分生孢子產(chǎn)量分別是未處理對照最高分生孢子產(chǎn)量的1.29倍和1.46倍。說明DMI能夠促進炭疽菌在植物組織上的產(chǎn)孢量增加，具有影響病害田間病害流行的風險。

3、麥角甾醇生物合成途徑相關的差異基因分析

在真菌中，麥角甾醇是由乙酰輔酶A（乙酰輔酶A）通過復雜途徑合成的。釀酒酵母中的麥角甾醇生物合成步驟研究較為透徹，共有21個基因參與麥角甾醇生物合成。我們從C. fructicola中找到了相關同源基因。在苯醚甲環(huán)唑脅迫下，在參與麥角甾醇生物合成的基因中，與對照相比， Erg11（DMI殺菌劑的靶標，在真菌中被稱為CYP51）基因被發(fā)現(xiàn)上調(diào)。Erg6、Erg27、Erg3和Erg5基因表達量也上調(diào)。與對照組相比，Erg4基因受到抑制。苯醚甲環(huán)唑處理后，其他15個基因的表達水平?jīng)]有顯著變化。說明：DMI類殺菌劑對炭疽菌產(chǎn)孢的促進作用可能與麥角甾醇合成途徑中基因表達量的變化及甾醇種類變化有關。

4.與產(chǎn)孢調(diào)控有關的差異基因分析

通過局部BLAST搜索，找到了幾乎所有已知與分生孢子形成有關的31個同源基因。在這些基因中，AbaA和WetA是真菌產(chǎn)孢的中央調(diào)節(jié)因子，幾乎所有環(huán)境因子對產(chǎn)孢的調(diào)控均需通過中央調(diào)節(jié)因子。在苯醚甲環(huán)唑脅迫下，中央調(diào)節(jié)因子AbaA和WetA基因的表達顯著增加，該結(jié)果從基因表達層面進一步驗證了DMI對炭疽菌產(chǎn)孢的促進作用。NsdC、NsdD、PpoA、PpoB、OsaA和PpoC在發(fā)育平衡中發(fā)揮作用，苯醚甲環(huán)唑脅迫下PpoC的表達顯著增加。FluG、SfgA、FlbA、FlbB、FlbC、FlbE和FlbD參與FluG介導的信號通路，苯醚甲環(huán)唑脅迫下，F(xiàn)lbA和FlbD的表達水平顯著升高，而SfgA的表達水平顯著降低。其他14個基因在光依賴性信號通路（LreA、LreB和FphA）、MAP激酶信號通路（MpkB、MkkB、SteC和SteD）、G蛋白信號通路（FadA和PkaA）、轉(zhuǎn)錄因子（SltA、AreA、ZipA、MtfA和RlmA）和Velvet家族蛋白（VelB和VosA）中發(fā)揮作用，這些基因的表達量在苯醚甲環(huán)唑脅迫下沒有顯著改變。該研究結(jié)果表明：環(huán)境DMI殺菌劑脅迫信號可能通過FluG信號通路傳導至中央調(diào)節(jié)因子。

總結(jié)

在PDA培養(yǎng)基和植物組織上，低濃度的DMI殺菌劑能促進炭疽菌的產(chǎn)孢，而線粒體呼吸抑制劑（QoIs）對炭疽菌的產(chǎn)孢沒有顯著影響。轉(zhuǎn)錄組學分析表明，DMI殺菌劑信號可能通過FluG介導的信號通路傳遞到中央調(diào)控通路，進一步證實了DMI殺菌劑促進炭疽菌產(chǎn)孢的形態(tài)學效應。

研究結(jié)果表明，殺菌劑對病原真菌的生長和繁殖具有雙向作用，本研究為科學合理地使用殺菌劑提供了新的依據(jù)。