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英文名稱：N6-methyladenosine reader IMP2 stabilizes the ZFAS1/OLA1 axis and activates the Warburg efect: implication in colorectal cancer
中文名稱：N6-甲基腺苷（m6A）閱讀蛋白IMP2能穩(wěn)定ZFAS1/OLA1軸并激活沃伯格效應：在結直腸癌中的意義
雜志名稱：J Hematol Oncol.
影響因子：17.233
摘要
背景：越來越多的證據(jù)表明N6-甲基腺嘌呤（m6A）調(diào)節(jié)因子有助于結直腸癌（CRC）的病因?qū)W和進展研究。然而，參與糖酵解代謝的m6A閱讀蛋白的確切機制仍然模糊不清。本文旨在將m6A閱讀蛋白與糖代謝串聯(lián)起來，揭示一種CRC進展的新機制。
方法：通過生物信息學、ISH和IHC檢測，分析了候選lncRNA和m6A閱讀蛋白之間的關系。利用體內(nèi)和體外研究（包括MTT、CFA、反式孔、細胞凋亡、免疫印跡、qRT-PCR和異種移植小鼠模型）來探討這些指標的生物學功能。利用乳酸檢測、ATP活性檢測和ECAR檢測驗證其下游靶點的生物學功能。利用生物信息學、RNA穩(wěn)定性、RIP實驗和RNA下拉實驗探索其潛在的分子機制。
結果：本文發(fā)現(xiàn)在CRC增殖和進展過程中，m6A閱讀蛋白IMP2與長鏈非編碼RNA（lncRNA）ZFAS1以依賴m6A調(diào)節(jié)的方式進行串聯(lián)，隨后增強了OBG-樣ATPsae1（OLA1）和腺嘌呤三磷酸（ATP）水解和糖酵解的募集。
材料方法
實驗樣本：144對CRC組織和對應的癌旁組織；CRC細胞系和正常人腸道上皮細胞系
實驗方法：lncRNA-mRNA芯片測序，qPCR，WB蛋白印跡分析，組織微陣列（TMA）和免疫組化（IHC），lncRNA ISH檢測，細胞增殖實驗，細胞克隆實驗（CFA），細胞凋亡檢測，細胞遷移實驗，免疫熒光實驗（IF），m6A斑點實驗，RNA穩(wěn)定性測定， RNA下拉實驗 ，RIP-PCR檢測，ATP含量檢測，LD含量檢測，ATP酶活性檢測，細胞外酸化速率測定（能發(fā)高分文章的秘訣）。
結果
1、CRC細胞和組織中l(wèi)ncRNA的失調(diào)與IMP1/2/3的表達相關
在CRC組織中，只有IMP2表達量比較高，且遠高于IMP1和IMP3（圖1b）。同樣發(fā)現(xiàn)IMP2在7個CRC細胞系（(LOVO，CACO2，SW48，SW480，HT29，HCT116和 SW620)中的表達量也高于結直腸上皮細胞中的表達量（圖1c）。而m6A斑點實驗檢測結果表明，總m6A在CRC細胞系（特別是HCT116、SW620和HT29細胞系）中的水平要高于正常結直腸上皮細胞（圖1d）。這和之前對IMP2的功能研究結論一致，即穩(wěn)定RNA的表達，增加總RNA的m6A水平。
然后分析了m6A閱讀蛋白IMP1/2/3的RNA免疫沉淀測序（RIP-seq)數(shù)據(jù)以及TCGA中的數(shù)據(jù)，獲得了7個候選的lncRNA。其中ZFAS1、SNHG15和CRNDE表現(xiàn)出明顯的高表達（圖1e）。在CRC細胞中，ZFAS1表現(xiàn)出最明顯的高表達（圖1f）。在IMP1/2/3和ZFAS1之間計算相關性，發(fā)現(xiàn)ZFAS1和IMP2之間存在明顯的正相關（圖1g）。
為了研究IMP2在ZFAS1表達中的潛在作用及其相關的m6A甲基化水平，本文進行了組織微陣列（TMA）、RNA原位雜交（ISH）和免疫組化（IHC）檢測，分析CRC組織樣本和對應的癌旁組織（n=144）中IMP、m6A和ZFAS1的表達（圖1h）。值得注意的是，在CRC組織中，IMP2、ZFAS1的表達和m6A的甲基化水平急劇增加（圖1i）。進一步進行相關模式分析，表明IMP2和ZFAS1的表達和m6A水平呈現(xiàn)正相關性（圖1j）。
為了進一步探討這些指標在隊列中作為獨立預后因素的臨床效用，對144例CRC組織和癌旁組織進行了秩和檢驗和多變量cox回歸分析，發(fā)現(xiàn)IMP2表達量的升高顯著縮短了總生存期（OS）和無病生存期（DFS），m6A甲基化的高表達與不良的OS和DFA顯著相關，而ZFAS1表達量高的CRC患者的OS急劇下降。DFS也明顯下降（圖1k）。說明IMP2、m6A和ZFAS1的表達與CRC患者的生存狀況有著明顯的相關性。
總之，這些結果表明IMP2在CRC細胞和組織中高表達，并伴隨著相關的m6A甲基化水平和ZFAS1的表達。這些指標也表示了其作為獨立的預后預測因子的潛在功能，可用于未來的CRC評估和治療的生物標志物。
圖1（上下滑動查看）
2、CRC細胞中IMP2通過直接與ZFAS1的m6A位點結合促進ZFAS1的穩(wěn)定性
為了探索在CRC腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，IMP2介導的m6A甲基化穩(wěn)定性及其相關的ZFAS1表達的關鍵生物學特征，在HCT116和SW620細胞系中檢測干擾IMP2后的IMP2和ZFAS1的表達。結果表明異位IMP2的表達明顯地增強了ZFAS1和IMP2的表達。然而通過qPCR定量分析發(fā)現(xiàn)IMP2的敲除抑制了HCT116和SW620中ZFAS1和IMP2的表達（圖2b）。在IMP2敲除的CRC細胞中，通過上調(diào)ZFAS1的表達來進行拯救實驗，通過qPCR發(fā)現(xiàn)ZFAS1的表達的確得到了恢復（圖2c）。更重要的是，RNA穩(wěn)定性分析進一步確定了與空載體處理的細胞相比，IMP2敲除或在不同時間點(0,2,4,6 h)進行放線菌素D治療的HCT116和SW620 細胞中ZFAS1 RNA的半衰期是減少的（圖2d）。這些發(fā)現(xiàn)說明IMP2作為一個m6A閱讀蛋白對ZFAS1有穩(wěn)定作用。
為了驗證IMP2和ZFAS1之間的直接關聯(lián)，初步分析了FLAG標記的IMP1/2/3的RIP-seq數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)和對照相比，異位IMP2的表達極大地豐富了HEK293T細胞的內(nèi)源性ZFAS1（圖2e)。此外，RNA結合蛋白的數(shù)據(jù)說明IMP2蛋白有一個特定的結合域可以識別ZFAS1中的m6A motif（圖2f）。為了進一步驗證IMP2和ZFAS1結合位點的可靠性，進行了共定位的ISH和免疫熒光（IF）檢測，結果發(fā)現(xiàn)ZFAS1和IMP2的表達分布相一致，主要結合位點在HCT116和SW620的細胞質(zhì)中，部分在細胞核中（圖2j）。RIP分析發(fā)現(xiàn)相比對照組，用m6A抗體富集得到了更高表達的ZFAS1（圖2k），RNA下拉實驗說明了通過攜帶m6A motif與IMP2蛋白特定結構域可以直接結合（圖2m）。利用qPCR驗證IMP2 KH3-4的WT和Mut載體處理后的HEK293T細胞中ZFAS1的表達，發(fā)現(xiàn)表達量顯著減少（圖2i），說明IMP2 KH3-4結構域可以與ZFAS1直接相互作用。
以上數(shù)據(jù)結果說明IMP2通過KH3-4直接與ZFAS1上的m6A位點結合，并增強了ZFAS1的穩(wěn)定性（圖2a）。
圖2（上下滑動查看）
3、IMP2通過調(diào)節(jié)ZFAS1在CRC細胞中的表達來調(diào)控生物學特性
為了進一步明確在CRC細胞中IMP2和ZFAS1特異性的調(diào)控模式，首先通過MTT實驗（圖3b）和細胞克隆實驗（CFA）（圖3c）分析了干擾IMP2表達后的HCT116和SW620細胞系的細胞增殖能力和細胞克隆能力。結果發(fā)現(xiàn)異位IMP2的表達顯著促進了CRC細胞的生長和克隆能力，而IMP2的耗竭抑制了CRC細胞的增殖。此外還檢測了細胞侵襲能力（圖3d），發(fā)現(xiàn)在沉默IMP2時，細胞的遷移受到了明顯的抑制，而IMP2的過表達極大地提高了HCT116和SW620細胞系的侵襲能力。還發(fā)現(xiàn)IMP2的敲除增加了CRC細胞的凋亡率，IMP2的過表達會抑制CRC細胞的凋亡率（圖3e）。后續(xù)通過拯救實驗表明ZFAS1的過表達逆轉了對CRC細胞的促進作用，包括細胞增殖能力、細胞克隆能力、細胞遷移能力和細胞凋亡率（圖3f-i）。
這些結果說明IMP2通過促進ZFAS1的穩(wěn)定性和表達來增加CRC細胞的增殖，抑制CRC細胞的凋亡，并促進細胞侵襲和轉移，而IMP2對細胞表型的影響可以通過調(diào)節(jié)ZFAS1的表達來恢復。
圖3（上下滑動查看）
4、在CRC細胞中鑒定到OLA1是IMP2穩(wěn)定的的ZFAS1的關鍵靶點
為了進一步挖掘影響CRC細胞表型和功能的ZFAS1的下游靶點，在CRC細胞中進行了相關的功能研究。首先通過熱圖分析發(fā)現(xiàn)了與ZFAS1過表達正相關的潛在下游靶點，并通過公開數(shù)據(jù)集進行驗證（圖4a，b)。交集結果中發(fā)現(xiàn)了線粒體能量代謝相關基因OLA1，進一步通過qPCR檢測發(fā)現(xiàn)與對照細胞相比，OLA1在7個CRC細胞系中顯著過表達（圖4c）。同樣在CRC組織和癌旁組織的qPCR結果中發(fā)現(xiàn)，OLA1的表達在CRC組織中更高（圖4d）。結果說明OLA1在CRC的組織和細胞樣本中都是高表達的，且OLA1和ZFAS1的表達模式高度一致。
隨后采用TMA和IHC檢測OLA1的表達（圖4e），通過RCO曲線評估OLA1的低/高表達，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，CRC組織中觀察到明顯的OLA1表達，表現(xiàn)出致癌基因的特性（圖4e，f）。且OLA1與ZFAS1的表達存在正相關性（圖4g）。與臨床數(shù)據(jù)做相關性分析，結果表明OLA1低表達的患者占比較高（圖4h），OLA1高表達的CRC患者的DFS和OS時間明顯縮短了（圖4i）。后續(xù)針對OLA1是否是ZFAS1的下游靶點做驗證，IMP2沉默/過表達不僅降低/增加了OLA1 mRNA的表達，而且降低/增加了OLA1蛋白的表達。但是IMP2對OLA1的影響可以被ZFAS2完全逆轉（圖4j-l）。
這些發(fā)現(xiàn)表明在CRC細胞和組織中，OLA1受到被m6A修飾和m6A穩(wěn)定的ZFAS1表達的正向調(diào)控，進一步的預后評估揭示OLA1可以成為預測CRC臨床結果的一個潛在生物標志物。
圖4（上下滑動查看）
5、ZFAS1通過與OLA1的OBG型功能域結合增強OLA1的活性并激活糖酵解代謝
接下來通過ISH和IF實驗證明ZFAS1和OLA1在CRC細胞中的共定位。結果表明，OLA1和ZFAS1不僅持續(xù)分布在HCT116和SW620細胞系的細胞質(zhì)中，而且還分布在細胞核中（圖5b）。為了確定ZFAS1是否與OLA1有直接的結合位點，并研究ZFAS1中關鍵的m6A位點對OLA1的影響，本研究將ZFAS1的三個A堿基替換成U堿基，并重新預測了
ZFAS1的三級結構。有趣的是，ZFAS1-WT和ZFAS1-Mut都是與OLA1的OBG型功能域結合，而且ZFAS1-WT和OLA1的結合強度遠遠高于ZFAS1-Mut和OLA1的結合強度（圖5c）。RNA下拉實驗表明，ZFAS1-WT的探針能顯著下拉OLA1，而當ZFAS1的m6A位點發(fā)生突變時，ZFAS1-WT不能再下來OLA1（圖5d）。所有結果說明OLA1蛋白特異性結構域能和含有ZFAS1-OLA1結合motif之間有直接結合作用。此外，OLA1表達的減少導致其ATP酶活性的降低，而ZFAS1的過度表達可以恢復OLA1的ATP酶活性。但是當ZFAS1的關鍵m6A位點發(fā)生突變時，ZFAS1對OLA1的ATP酶活性的恢復作用也消失了（圖5e）。這也證明了ZFAS1對OLA1的ATP酶活性的促進作用取決于ZFAS1和OLA1的結合。
接下來探索OLA1的ATP酶活性的變化對CRC細胞能量代謝的影響，研究了HCT116和SW620細胞系中乳酸和ATP的含量。發(fā)現(xiàn)OLA1表達的減少不僅可以降低乳酸的積累，還可以減少細胞中ATP的含量（圖5f，g）。通過細胞外酸化率的測定檢測OLA1的變化對CRC細胞的糖酵解代謝能力的影響，發(fā)現(xiàn)OLA1表達的減少可以顯著降低CRC細胞的糖酵解代謝能力，ZFAS1-WT可以恢復OLA1表達減少對CRC細胞糖酵解代謝能力的影響（圖5h）。
總之，ZFAS1可以直接與OLA1的OBG型功能域結合，從而增強OLA1的ATP水解能力，促進乳酸的積累，激活了CRC細胞的糖酵解途徑，最終促進CRC能量的釋放（圖5a）。
圖5（上下滑動查看）
6、IMP2-ZFAS1-OLA1信號軸影響到線粒體能量代謝
通過電子顯微鏡觀察到IMP2沉默后線粒體形態(tài)發(fā)生變化，即發(fā)現(xiàn)CRC細胞中線粒體明顯腫脹和受損，IMP2沉默后線粒體的形態(tài)回復正常（圖6b）。同時IMP2的過度表達促進了HK2（糖酵解的關鍵蛋白）的表達，抑制了PDHA1（氧化磷酸化的關鍵蛋白）的表達（圖6c）。然而ZFAS1沉默/過度表達和IMP2過表達/沉默后，HK2和PDHA1的表達水平得到恢復（圖6d）。
IMP2的過度表達明顯增強了乳酸和ATP的釋放，還發(fā)現(xiàn)IMP2敲除導致乳酸和ATP含量的釋放大幅度減少，而ZFAS1可以完全逆轉IMP2的影響（圖6e，f）。細胞能量代謝檢測進一步表明IMP2沉默減弱了細胞的糖酵解代謝能力，而ZFAS1可以逆轉IMP2沉默對糖酵解水平降低的影響（圖6g，h）。
總而言之，這些發(fā)現(xiàn)表明IMP2以依賴m6A的方式穩(wěn)定ZFAS1的表達，與OLA1介導的線粒體能量代謝有著重要的聯(lián)系。
圖6（上下滑動查看）
7、IMP2在體內(nèi)通過穩(wěn)定ZFAS1促進細胞增殖
利用異體移植模型驗證IMP2-ZFAS1-OLA1信號軸在體內(nèi)的生物學功能（圖7a），預后評估顯示異種移植小鼠在與shIMP2和ZFAS1載體共同轉染后，生存時間明顯縮短（圖7b），表明IMP2和ZFAS1在CRC預后評估中具有協(xié)同作用。此外，轉染shIMP2載體的異種移植小鼠中，腫瘤體積、大小和重量都明顯減少；然而，在與shIMP2和ZFAS1載體共同轉染后，腫瘤體積、大小和重量急劇增加（圖7c-e）。實驗結果說明在異種移植模型中，ZFAS1的過表達明顯地逆轉了IMP2沉默對腫瘤生長的抑制作用（圖7f）。
總之，體內(nèi)實驗表明，通過利用m6A誘導的穩(wěn)定性的IMP2與ZFAS1/OLA1軸的相互作用，IMP2敲除抑制了異種移植模型的腫瘤生長和惡化。
圖7（上下滑動查看）
結論
本文揭示了IMP2-ZFAS1-OLA1信號軸在CRC腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的新調(diào)節(jié)機制。在CRC細胞中，IMP2正向調(diào)節(jié)lncRNA ZFAS1。異位IMP1增強了ZFAS1的穩(wěn)定性和表達，而敲除IMP2會抑制ZFAS1的表達?；赗NA識別的motif，IMP2蛋白的KH3-4結構域在功能上被認為是直接與RNA結合的結構域，促進了ZFAS1中+843 m6A位點的RNA識別。此外，ZFAS1直接與OLA1結合，增強了OLA1的ATP酶活性，介導了線粒體的能量代謝，包括ATP水解和糖酵解代謝的生物過程，并最終影響到CRC細胞命運?？偟膩碚f，本文在結直腸癌預防和治療中發(fā)現(xiàn)了一個新的信號軸，即識別到新的靶點和將m6A表觀遺傳修飾與線粒體能量轉換串聯(lián)起來。
圖8（上下滑動查看）
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參考文章：
Lu S, Han L, Hu X, et al. N6-methyladenosine reader IMP2 stabilizes the ZFAS1/OLA1 axis and activates the Warburg effect: implication in colorectal cancer. J Hematol Oncol. 2021;14(1):188. Published 2021 Nov 7. doi:10.1186/s13045-021-01204-0
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