【百邁客成功案例】通過(guò)根瘤菌和叢枝菌根真菌在鎘污染土壤中的共接種提高苜蓿對(duì)鎘脅迫的抗性

中文名: 通過(guò)根瘤菌和叢枝菌根真菌在鎘污染土壤中的共接種提高苜蓿對(duì)鎘脅迫的抗性

英文名: Improvement of alfalfa resistance against Cd stress through rhizobia and arbuscular mycorrhiza fungi co-inoculation in Cd-contaminated soil

雜志：Environmental Pollution，2021

影響因子：8.071

 

研究背景

根瘤菌和叢枝菌根真菌（AMF）是重要的共生微生物，對(duì)生長(zhǎng)在金屬污染土壤中的植物有利。然而，目前仍不清楚接種的微生物如何影響根際微生物群落，或者根際微生物群落的后續(xù)變化是否有助于提高金屬脅迫下的植物抗性。

研究目的

研究接種根瘤菌和AMF對(duì)苜蓿抗鎘（Cd）脅迫的影響，利用16S和ITS rRNA基因的高通量測(cè)序，進(jìn)一步分析了根際微生物群落接種后的響應(yīng)及其在提高紫花苜?？剐苑矫娴淖饔谩?/p>

技術(shù)路線

研究結(jié)果

1、根際土壤理化性質(zhì)

根據(jù)雙因素方差分析的結(jié)果，Cd、接種處理及其相互作用對(duì)NO3–N， NH4 +-N ，SOC和AP含量有顯著影響（P<0.05）。對(duì)于所有Cd處理，除土壤pH值外，SOC含量，SOC:TN和SOC:TP比值均高于對(duì)照。此外，共同接種顯著增加了NH4+-N和AP含量。

2、植物的物理化學(xué)性質(zhì)和植物組織對(duì)Cd的吸收情況

添加Cd和接種根瘤菌以及AMF都顯著影響紫花苜蓿生物量，包括芽和根(P＜0.01；表1)。此外，接種處理大大提高了紫花苜蓿的芽和根生物量，而添加Cd則顯著降低了紫花苜蓿的芽和根生物量（P＜0.01）。例如，在添加Cd的根瘤菌和AMF共同接種的處理中，紫花苜蓿生物量最高（3.35±0.116 g /pot）。此外，紫花苜蓿芽和根中的Cd濃度顯著受Cd添加、接種及其相互作用的影響。接種和Cd處理大大增加了紫花苜蓿芽和根的Cd吸收含量（表1）。與對(duì)照(未接種)相比，所有接種處理下根中的Cd含量均高于芽中的Cd含量(P <0.05)。此外，相對(duì)于對(duì)照而言，在添加Cd后，接種處理芽中的Cd濃度均高出1.2倍。在添加Cd的共同接種處理中，芽中Cd的總吸收量最高(30.6±1.81mg/pot)。與添加Cd的對(duì)照(未接種)相比，單獨(dú)接種和共同接種處理的芽中，Cd的總吸收量顯著更高（系數(shù)分別為1.4和1.6），（P <0.05）。在單獨(dú)接種和未接種處理中，根瘤菌和AMF共同接種處理的總Cd吸收量最高。

接種后，芽和根的抗氧化能力明顯增強(qiáng)，其中AR、AM和ARM處理的SOD、CAT和POD活性均顯著高于A處理（P＜0.05；表2）。與未接種和單獨(dú)接種處理相比，根瘤菌和AMF共同接種處理中紫花苜蓿的SOD、CAT和POD活性最高。例如，在ARM處理中，芽的SOD活性比A處理大1.4倍。AR、AM和ARM處理中芽的MDA含量明顯低于A處理(分別降低27.28%、21.81%和34.09%)(P＜0.05；表2)。此外，與對(duì)照未接種植物相比，共同接種處理中MDA、H2O2和O2-含量最低。

表1 生物量、Cd含量和植物組織對(duì)Cd的吸收。

表2 不同處理中植物芽的丙二醛(MDA)、活性氧(O2-，H2O2)和抗氧化酶(超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)和過(guò)氧化物酶(POD))含量。

3、根際微生物群落的α多樣性

所有土壤樣品共鑒定出4847280條高質(zhì)量的微生物序列，其中真菌序列2593280條，細(xì)菌序列2254000條，在97%的相似度截止水平下，可分別聚類為904和197個(gè)OTU。對(duì)于細(xì)菌群落來(lái)說(shuō)，OTU、ACE、Chao1、Simpson和Shannon-Wiener指數(shù)均受到Cd添加、接種及其相互作用的顯著影響(P＜0.05；圖1)。特別是在接種處理下，Cd的添加大大降低了細(xì)菌Simpson多樣性指數(shù)。在添加Cd的情況下，接種顯著降低了細(xì)菌Simpson多樣性指數(shù)，而在對(duì)照處理中則增加了細(xì)菌Simpson多樣性指數(shù)。對(duì)于真菌群落來(lái)說(shuō)，Cd的添加、接種以及它們之間的相互作用對(duì)Chao1和Simpson多樣性指數(shù)都有明顯的影響。特別是在所有接種處理下，Cd的添加都顯著提高了真菌的Simpson多樣性指數(shù)（P＜0.05；圖1）。接種與添加Cd處理和對(duì)照處理都能顯著提高真菌的Simpson多樣性指數(shù)。添加Cd處理和對(duì)照處理，接種后均可顯著提高真菌的Simpson多樣性指數(shù)。

圖1 不同處理之間細(xì)菌（A，B），真菌（C，D）α多樣性的差異。

4、根際微生物群落的結(jié)構(gòu)

我們的研究在所有不同的處理中檢測(cè)到了10個(gè)細(xì)菌門(mén)類(相對(duì)豐度>1%)，即變形菌門(mén)（Proteobacteria）、放線菌門(mén)（Actinobacteria）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）、藍(lán)藻細(xì)菌門(mén)（Cyanobacteria）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）、髕骨細(xì)菌門(mén)（Patescibacteria）、芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes）和疣微菌門(mén)（Verrucomicrobia） (圖2A)。相對(duì)豐度<1%的其他種群被歸為”Others”。在所有處理中，Bacteroidetes、Actinobacteria、Proteobacteria和Firmicutes是主要的細(xì)菌門(mén)。Cd添加、接種及其相互作用顯著影響了Firmicutes、Bacteroidetes和Acidobacteria的相對(duì)豐度。特別是Cd的添加，明顯降低了所有接種(AR、AM和ARM)處理中Actinobacteria的相對(duì)豐度，而增加了兩個(gè)接種(AM和ARM)處理中Firmicutes的相對(duì)豐度。

我們的研究在所有不同的處理中檢測(cè)到了10個(gè)真菌門(mén)類(相對(duì)豐度>1%)，即子囊菌門(mén)（Ascomycota）、Unclassified、擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota）、球囊菌門(mén)（Glomeromycota）、被孢霉門(mén)（Mortierellomycota）、壺菌門(mén)（Chytridiomycota）、毛霉門(mén)（Mucoromycota）、尾蟲(chóng)門(mén)（Cercozoa）、油壺菌門(mén)（Olpidiomycota）和羅茲菌門(mén)（Rozellomycota） (圖2B)。在所有處理中，占主導(dǎo)地位的真菌門(mén)為Ascomycota（44.3-65.7%）和Unclassified（14.9-36.6%）。Cd的添加顯著影響了Cercozoa和Rozellomycota的相對(duì)豐度，接種后極大地影響了Glomeromycota、Mortierellomycota和Rozellomycota的相對(duì)豐度(P <0.05)。其他菌類在真菌群落組成中只占很小的一部分，如Basidiomycota和Glomeromycota。同時(shí)，對(duì)指示菌種的分析表明，從門(mén)到科水平的這些細(xì)菌類群(Proteobacteria、Actinobacteria、Acidobacteria、Chloroflexi、Bacteroidetes和Firmicutes)和真菌類群(Glomeromycota、Mortierellomycota和Rozellomycota)都是根瘤菌和AMF共同接種后根際微生物群落的主要指標(biāo)(表3)。

雙因素方差分析表明，添加Cd、接種及其相互作用極顯著地影響了細(xì)菌和真菌的群落結(jié)構(gòu)(P＜0.001)。此外，NMDS和ANOSIM分析表明，真菌和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在Cd和接種處理中均有顯著差異(P＜0.001；圖3)。部分Mantel檢驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，添加Cd和接種處理與真菌和細(xì)菌群落內(nèi)的異質(zhì)性都有很大的相關(guān)性。

圖2 不同處理中主要細(xì)菌（A）和真菌（B）類群的相對(duì)豐度。

表3 通過(guò)添加Cd處理后的指示性類群分析，在門(mén)類水平將分類群確定為根際潛在指標(biāo)。

圖3 從Bray-Curtis距離矩陣得出的非度量多維標(biāo)度（NMDS）排序圖。

5、微生物群落與土壤特性的關(guān)系

Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，Cd、OTU和細(xì)菌群落的α多樣性指數(shù)(即Shannon、Simpson、Chao1和ACE)之間存在顯著的相關(guān)性(P＜0.05)。除Shannon指數(shù)外，SOC、TN、SOC:TN和SOC:TP與OUT以及細(xì)菌群落中的這些α多樣性指數(shù)之間存在顯著的相關(guān)性。但是，除了真菌群落的OTU和Shannon與SOC和SOC:TN外，真菌群落的α多樣性指數(shù)與這些土壤性質(zhì)之間沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的相關(guān)性。

VPA的結(jié)果表明，土壤性質(zhì)和Cd含量一般能解釋細(xì)菌群落的大部分變化（62.8%），而它們只能解釋真菌群落12.9%的變化（圖4A和B）。Mantel檢驗(yàn)和相關(guān)分析表明，除TP和SOC:TP外，其他土壤變量均與細(xì)菌群落顯著相關(guān)，而只有Olsen-P和pH值對(duì)真菌群落有顯著影響（圖4C）。此外，RDA還證實(shí)，與不同處理的真菌群落相比，土壤變量對(duì)不同處理的細(xì)菌群落有更明顯的影響。根據(jù)相關(guān)性熱圖和RDA或CCA，細(xì)菌群落中的Actinobacteria、Bacteroidetes、Firmicutes、Acidobacteria和Chloroflexi與除TP外的其他土壤變量顯著相關(guān)(P＜0.05；圖4D)。然而，在真菌群落中，只有Chytridiomycota、Olpidiomycota和Rozellomycota與大多數(shù)土壤變量表現(xiàn)出明顯的相關(guān)性(P <0.05；圖4E)。

圖4 變異分區(qū)分析顯示了細(xì)菌（A）和真菌（B）群落解釋的土壤特性和土壤Cd的差異百分比。土壤變量與微生物群落結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系（C）。細(xì)菌類群（門(mén)水平，D）和真菌類群（門(mén)水平，E）與土壤特性的相關(guān)熱圖。

6、接種和添加Cd處理與微生物群落、土壤特性、植物生物量和Cd吸收的級(jí)聯(lián)關(guān)系

PLS-PM表明，接種根瘤菌和ARM直接影響真菌和細(xì)菌多樣性，間接影響抗氧化酶活性、脂質(zhì)過(guò)氧化和苜蓿生物量。接種對(duì)細(xì)菌多樣性（OTU、ACE、Chao-1、Simpson和Shannon指標(biāo)）有正向影響，但對(duì)真菌多樣性無(wú)顯著影響。接種正向影響抗氧化酶活性和苜蓿生物量，負(fù)向影響脂質(zhì)過(guò)氧化（圖5D）。接種對(duì)抗氧化酶活性（0.60）和植物生物量（0.55）的影響最大。

圖5 處理（接種和添加Cd）與微生物群落、土壤特性和植物抗性的級(jí)聯(lián)關(guān)系。偏最小二乘路徑模型(PLS-PM)剖析了處理、微生物群落和土壤特性對(duì)植物抗性的主要影響途徑(A)(B)；以及每個(gè)變量對(duì)植物生物量、抗氧化酶和脂質(zhì)過(guò)氧化物的總影響(C)(D)。

 

討論

1、 根瘤菌與AMF共接種對(duì)Cd脅迫下植物抗性的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，苜蓿生長(zhǎng)4個(gè)月后生物量明顯增加，根瘤菌和AMF處理的生物量最高（表1）。與未接種的處理相比，使用根瘤菌或AMF的單次接種處理伴隨著生物量的增加和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的獲得。有的研究表明，接種AMF增加了豆科植物的根瘤數(shù)量，這表明菌根的形成提供了足夠的磷（P）來(lái)支持根瘤和類桿菌的生長(zhǎng)。在所有接種處理中，根瘤菌和AMF共接種處理對(duì)緩解苜蓿Cd脅迫的總體效果最大。

補(bǔ)救策略的可行性在很大程度上取決于土壤中殘留重金屬的生物活性及其在植物中的利用率。根瘤菌和AMF共同接種處理中，紫花苜蓿芽和根的Cd吸收總量明顯高于單獨(dú)接種或未接種處理（表1）。苜蓿芽中的Cd濃度保持穩(wěn)定，說(shuō)明接種可防止Cd在植物組織中過(guò)量積累，同時(shí)可以促進(jìn)植物生物量的增加（表1）。此外，Cd主要積累在根部，轉(zhuǎn)移到芽上的Cd量極少，這阻礙了芽上出現(xiàn)的Cd誘導(dǎo)的中毒癥狀的發(fā)生，從而有利于植物穩(wěn)定。

2、 根瘤菌與AMF共接種對(duì)Cd脅迫下植物抗性的影響

探究根瘤菌與AMF共接種提高植物抗病性的途徑是揭示接種促進(jìn)生長(zhǎng)機(jī)制的關(guān)鍵。在我們的研究中，接種微生物顯著增加了Cd脅迫下紫花苜蓿根際細(xì)菌多樣性，降低了真菌多樣性，說(shuō)明共接種有利于細(xì)菌群落多樣性的恢復(fù)；而添加Cd則不利于真菌群落多樣性的恢復(fù)（圖1）。群落多樣性反映了群落的穩(wěn)定性和功能多樣性，因此，與真菌群落相比，細(xì)菌群落對(duì)苜?？笴d脅迫的輔助潛力更大。此外，PLS-PM還確定了Cd脅迫下細(xì)菌多樣性對(duì)抗氧化酶活性和苜蓿生物量的顯著正相關(guān)關(guān)系（圖5）。

對(duì)于真菌類群，在AMF接種后，Glomeromycota的相對(duì)豐度顯著增加（AMF屬于Glomeromycota）（圖2B）。另一方面，Mortierellomycota和 Rozellomycota相對(duì)豐度的下降可能是由于 Glomeromycota相對(duì)豐度的增加所致（圖 S1B）。因此，在根瘤菌和AMF共同接種后，這些細(xì)菌類群（增加的類群包括Proteobacteria、Actinobacteria、Acidobacteria和Chloroflexi，減少的類群包括Bacteroidetes和Firmicutes）和真菌類群（增加的分類群包括Glomeromycota，減少的分類群包括Mortierellomycota和Rozellomycota）可能是提高紫花苜蓿對(duì)Cd抗性的關(guān)鍵根際微生物區(qū)系。

以往的研究表明，許多微生物類群，即Proteobacteria、Actinobacteria、Acidobacteria和Chloroflexi(如Acidobacteria(GP1、GP3和GP6)、Rhizobiales、Burkholderiales、Pseudomonadales和Frankineae)可以幫助植物吸收養(yǎng)分，提高植物生產(chǎn)力。例如，S.meliloti可以誘導(dǎo)根瘤菌占據(jù)豆科植物的結(jié)節(jié)，以幫助養(yǎng)分吸收。有研究表明，根瘤菌也可能提供病害保護(hù)，在提供養(yǎng)分的根瘤菌占主導(dǎo)地位的根三葉植物的微生物組，被細(xì)菌屬富集。一項(xiàng)研究表明，根瘤菌也可能提供疾病保護(hù)，在三葉草屬的微生物組中，提供養(yǎng)分的根瘤菌占主導(dǎo)地位，這些微生物群由細(xì)菌屬富集。此外，已知許多細(xì)菌可以緩解鐵(Fe)、磷(P)、鎂(Mg)和鈣(Ca)的缺乏，從而防止它們因重金屬競(jìng)爭(zhēng)而轉(zhuǎn)移到植物根部。這些過(guò)程還可以通過(guò)增加根際中微量元素的利用率來(lái)促進(jìn)紫花苜蓿的生長(zhǎng)。因此，提高紫花苜蓿對(duì)Cd脅迫抗性的關(guān)鍵細(xì)菌類群的主要過(guò)程可能是它們?yōu)樽匣ㄜ俎Ｌ峁┝宋崭H營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并減少植物光合作用衍生的碳（C）釋放到土壤中的輔助作用（圖5）。

與細(xì)菌群落相反，VPA顯示真菌群落對(duì)土壤變量的影響較小(圖4A和B)，這與我們的結(jié)果一致，即除Olsen-P和pH值外，真菌群落與根際中的SOC和養(yǎng)分沒(méi)有很強(qiáng)的相關(guān)性(圖4C)。我們的結(jié)果表明，真菌群落在提高紫花苜?？笴d脅迫方面的相關(guān)效果低于細(xì)菌群落。這些結(jié)果也被發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵真菌類群和根際變量之間的微弱相關(guān)性所支持（圖4E）。但是，由AMF接種引起的這些關(guān)鍵真菌類群的變化強(qiáng)烈影響了關(guān)鍵細(xì)菌類群，這表明這些關(guān)鍵真菌類群可能通過(guò)影響細(xì)菌群落的方式在Cd脅迫下輔助苜蓿生長(zhǎng)中發(fā)揮間接作用。這些結(jié)果也闡明了根瘤菌和AMF共同接種與單獨(dú)接種相比促進(jìn)苜?？剐院蜕L(zhǎng)的原因。通過(guò)PLS-PM分析（圖5），關(guān)鍵的真菌類群對(duì)關(guān)鍵的細(xì)菌類群有直接影響，這對(duì)植物的抗性和生長(zhǎng)有間接的有利影響。一般來(lái)說(shuō)，在根瘤菌和AMF共同接種處理下，根瘤菌群落而非相應(yīng)的真菌群落主要提高了紫花苜蓿對(duì)Cd脅迫的抗性。

結(jié)論

對(duì)共生微生物如何影響根際微生物類群以協(xié)助苜蓿抵御Cd脅迫提供了新的認(rèn)識(shí)，根際群落成員間的相互作用或接種后群落組合的動(dòng)態(tài)是重要因素。與單一接種相比，根瘤菌和AMF聯(lián)合接種對(duì)苜蓿抗Cd脅迫的綜合效應(yīng)最大。根瘤菌和AMF共接種對(duì)主要細(xì)菌類群產(chǎn)生強(qiáng)烈影響，主要通過(guò)幫助植物從根際吸收養(yǎng)分和減少植物光合作用產(chǎn)生的C分配到土壤中來(lái)提高苜蓿對(duì)Cd脅迫的抗性。這些研究結(jié)果對(duì)進(jìn)一步提高植物的抗逆性，保證牧草和作物的生產(chǎn)具有重要意義。

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