引言
2021年12月4日，大連海洋大學(xué)海洋科學(xué)與環(huán)境學(xué)院在JCR Q1區(qū)期刊《Water Research》上發(fā)表了題為“Metagenomics combined with comprehensive validation as a public health risk assessment tool for urban and agricultural run-off”的研究論文，該論文提出了一個(gè)由病原體篩選、病原體基因分型和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估三個(gè)階段組成的公共健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估流程：1）運(yùn)用宏基因組測(cè)序、微流控芯片和qPCR對(duì)病原體進(jìn)行篩選，2）多位點(diǎn)序列分型(MLST)或常規(guī)PCR進(jìn)行病原菌分離和基因分型；3）對(duì)宏基因組數(shù)據(jù)的毒力基因進(jìn)行致病性評(píng)估。
譯名：宏基因組學(xué)結(jié)合綜合驗(yàn)證作為城市和農(nóng)業(yè)徑流公共健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工具
期刊：Water Research
影響因子：11.236
發(fā)表時(shí)間：2021年12月4日
合作單位：大連海洋大學(xué)海洋科技與環(huán)境學(xué)院
研究方法：宏基因組測(cè)序；微流控芯片；qPCR；MLST分型
研究背景
水生病原體可引起嚴(yán)重疾病，如霍亂、鉤端螺旋體病、傷寒或腹瀉。鑒于這些新出現(xiàn)的疾病的不可預(yù)測(cè)性和高度多樣性，水傳播病原體監(jiān)測(cè)的關(guān)鍵挑戰(zhàn)之一是優(yōu)先為局部暴發(fā)做好準(zhǔn)備。為應(yīng)對(duì)這些挑戰(zhàn)，該研究分三個(gè)步驟進(jìn)行公共衛(wèi)生風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估：潛在病原體篩選、病原基因型確認(rèn)、與當(dāng)?shù)嘏R床資料比較。
摘要
研究者選擇了兩個(gè)具有潛在公共衛(wèi)生問(wèn)題的地區(qū)(東港和湛江)進(jìn)行了宏基因組測(cè)序，對(duì)毒力基因進(jìn)行了致病性評(píng)估。結(jié)果表明，共檢測(cè)到90多種細(xì)菌病原體，其中56種含有毒力基因。在東港，發(fā)現(xiàn)了一株致病性不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter sp.)，在2018年和2020年達(dá)到了較高的豐度，所有致病性弧菌都在2019年10月達(dá)到頂峰。在湛江，鮑曼不動(dòng)桿菌（A. baumanni）等腸桿菌科細(xì)菌種類(lèi)在2019年和2020年大量存在，而氣單胞菌屬（Aeromonas）和弧菌屬（Vibrio spp）在2017年11月濃度達(dá)到頂峰。通過(guò)MLST對(duì)40個(gè)菌種進(jìn)行了分離與分型，其中一半是臨床上的流行基因型。此外，在2017年采集的水樣中發(fā)現(xiàn)了非洲豬瘟病毒(ASFV)，這在中國(guó)首次報(bào)告非洲豬瘟（2018年）之前，還檢測(cè)到甲型肝炎病毒(HAV)和腸道病毒71型(EV71)等RNA病毒，濃度分別在2020年4月和2018年4月達(dá)到峰值。HAV和EV71的動(dòng)態(tài)與當(dāng)?shù)亓餍汹厔?shì)一致。最后，基于毒力基因圖譜，該研究確定了兩個(gè)城市污水中的風(fēng)險(xiǎn)水平。這一工作流程說(shuō)明了對(duì)當(dāng)?shù)亓餍胁≡缙陬A(yù)警的可能性，有助于提前為當(dāng)?shù)氐奶囟ú≡w做好準(zhǔn)備。
研究方法
采樣點(diǎn)：東港市大洋河(DY)和東溝(DG)，湛江城區(qū)(DA)和農(nóng)業(yè)區(qū)(DB)
采樣時(shí)間：2017-2020年間，每年采集兩次水樣（半年一次）
檢測(cè)方法：MLST基因分型，微流控芯片篩選，病毒基因分型，宏基因組測(cè)序分析
實(shí)驗(yàn)流程：
圖1.廢水中新出現(xiàn)病原體風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的工作流程示意圖。
工作流程包括潛在病原體的篩選、病原體基因分型和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。
主要研究結(jié)果
1.東港水樣中潛在致病菌的篩選
在宏基因組數(shù)據(jù)中，89.3%的reads被分配到細(xì)菌中。參考毒力因子數(shù)據(jù)庫(kù)(VFDB)，使用MetaPhlAn2對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行分類(lèi)鑒定以進(jìn)一步研究潛在病原體。
在DY的宏基因組數(shù)據(jù)中大量檢測(cè)到40種病原體，包括水傳播致病菌和呼吸道致病菌。2019年后，鮑曼不動(dòng)桿菌、副溶血性弧菌、霍亂弧菌、溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌、肺炎克雷伯菌、腸沙門(mén)氏菌、結(jié)核分枝桿菌和空腸彎曲桿菌等幾種檢測(cè)到的病原體的相對(duì)豐度有所增加。相比之下，其他物種在2017年至2020年期間有所減少，例如韋羅尼氣單胞菌、嗜肺氣單胞菌和邦格里沙門(mén)氏菌(圖2B)，隨后培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)出其中32種細(xì)菌。
在DY數(shù)據(jù)中，城市污水中的細(xì)菌組成在2017年至2018年期間保持穩(wěn)定(圖4)。此后，變形桿菌的相對(duì)豐度在2019年4月至2019年下降到17.3%，但在2020年9月后成為優(yōu)勢(shì)類(lèi)群。宏基因組數(shù)據(jù)中共檢測(cè)到76種細(xì)菌病原體，其中32種用于可視化(圖2D)。致病性不動(dòng)桿菌屬在2018年和2020年達(dá)到了較高的相對(duì)豐度，所有致病性弧菌都在2019年10月達(dá)到頂峰，其他病原體的相對(duì)豐度沒(méi)有明顯的波動(dòng)。在32個(gè)選定的細(xì)菌病原菌中，在不同采樣時(shí)間的培養(yǎng)檢測(cè)中獲得17種(圖2D)。在研究期間，結(jié)核分枝桿菌、梅毒螺旋體和腸炎沙門(mén)氏菌的相對(duì)豐度保持不變，它們分別是結(jié)核病、梅毒和傷寒/副傷寒的臨床病原體。
圖2. 東港市農(nóng)業(yè)(DY)和城市污水(DG)采樣點(diǎn)細(xì)菌群落2017-2020年動(dòng)態(tài)
A：DY細(xì)菌群落相對(duì)豐度；B：DG中細(xì)菌群落相對(duì)豐度；C：DY樣品中細(xì)菌病原體的動(dòng)態(tài)；D：DG樣品中細(xì)菌病原體的動(dòng)態(tài)
2.東港地區(qū)細(xì)菌病原菌基因分型
對(duì)單個(gè)菌種進(jìn)行MLST基因分型，以確定是否屬于致病基因型。共分離出16種細(xì)菌進(jìn)行MLST，東港地區(qū)霍亂弧菌和副溶血性弧菌分別鑒定出3個(gè)和5個(gè)序列類(lèi)型（STs），其中僅副溶血性弧菌ST3在當(dāng)?shù)嘏R床中被確認(rèn)。7個(gè)肺炎克雷伯菌STs（包含ST11和ST23）被發(fā)現(xiàn)，并且在當(dāng)?shù)蒯t(yī)院相關(guān)感染中占主導(dǎo)地位。檢出5株嗜肺鏈球菌，但未檢出臨床病例，臨床和環(huán)境標(biāo)本中均檢出北京分支(ST4)結(jié)核分枝桿菌，環(huán)境中的腸鏈球菌ST34和ST19在當(dāng)?shù)鼗颊咧斜粰z出。對(duì)于其他病原體，除陰溝腸桿菌外，每種都檢測(cè)到6種STs，且至少有一種STs出現(xiàn)在臨床中。雖然一些致病基因型在當(dāng)?shù)氐呐R床樣本中沒(méi)有被鑒定出來(lái)，但它們是普遍存在的，如金黃色葡萄球菌ST7，因此仍需要進(jìn)一步的研究。
3.東港水樣中致病病毒的篩選
選擇了60種與公共衛(wèi)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的致病病毒，其中，通過(guò)將宏基因組reads比對(duì)到參考基因組確認(rèn)了20種DNA病毒，用微流控芯片對(duì)40種RNA病毒進(jìn)行了篩選，最后通過(guò)qPCR檢測(cè)確認(rèn)。
在DY發(fā)現(xiàn)了非洲豬瘟病毒(ASFV)和豬痘病毒(Swinpox Virus)等幾種病毒。ASFV在2017年10月被檢測(cè)到，并在2018年達(dá)到頂峰(圖6A)，并通過(guò)qPCR證實(shí)。qPCR在2018年4月后連續(xù)檢測(cè)到ASFV，其中2018年4月的病毒載量為3.0×103拷貝/L。在DG地點(diǎn)未檢測(cè)到ASFV和Swinpox病毒，在兩個(gè)地點(diǎn)均未檢測(cè)到其它人畜共患病DNA病毒。通過(guò)高通量微流控芯片檢測(cè)檢測(cè)了40種致病性RNA病毒的存在。DY樣品中，經(jīng)qPCR確認(rèn)，2019年僅檢測(cè)到諾如病毒、流行性腮腺炎病毒、鼻病毒和Human herpesvirus 6病毒。DG樣品中，2017年至2019年在樣本中檢測(cè)到human enterovirus 71 (EV71)，2020年4月檢測(cè)到Coxsackievirus 16 (CA16)。
4.東港水樣中病毒基因分型研究
對(duì)陽(yáng)性樣本進(jìn)行病毒基因分型，使用濃縮的DNA樣本對(duì)DY 2017和2018年水樣中ASFV B646L基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。從DY和其他國(guó)家的32個(gè)ASFV B646L序列數(shù)據(jù)中檢測(cè)到的B646L的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，前者與從遼寧和其他東歐國(guó)家的死豬中獲得的第一個(gè)ASFV分離物(CN201801/2018) 在基因上是相同的。對(duì)東港市手足口病流行時(shí)2019年4月達(dá)到峰值(5.8×102拷貝/L)的EV71濃度進(jìn)行了定量檢測(cè)(圖3B)，其中EV71的VP1基因PCR為陽(yáng)性，系統(tǒng)發(fā)育分析證實(shí)東港EV71屬于在遼寧省流行的C4a型，但PCR未擴(kuò)增出CA16基因片段。在DG樣品中，通過(guò)qPCR檢測(cè)，從2018年10月連續(xù)檢出了甲型肝炎病毒(HAV)，峰值在2020年4月(4.7×103拷貝/L)(圖5C)，這與甲型肝炎病例大幅增加的時(shí)間吻合。進(jìn)一步通過(guò)PCR擴(kuò)增得到甲型肝炎病毒VP3/P2A區(qū)，對(duì)100個(gè)公開(kāi)提供的甲型肝炎病毒基因組系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)DG中甲型肝炎病毒與大連分離株DL3(圖5C)有遺傳關(guān)系。其余陽(yáng)性檢測(cè)的病毒可能是由于病毒豐度低所致未被常規(guī)PCR擴(kuò)增出。
圖3.代表病毒的動(dòng)態(tài)變化和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。
5.湛江水樣中潛在致病菌的篩選
宏基因組數(shù)據(jù)中大約90%的reads與細(xì)菌相對(duì)應(yīng)。DA樣品中，變形菌門(mén)數(shù)量最多，其次是疣微菌門(mén)和放線(xiàn)菌(分別為35%和58%)(圖4A)。DB樣品中，變形菌門(mén)從2017年的50.1%增加到2020年的84.7%(圖4A)。兩個(gè)地點(diǎn)的微生物組成自2018年11月后出現(xiàn)了差異。在每個(gè)采樣時(shí)間，豐度 top20屬代表了微生物群落的35%到57%(圖5B)。在2019年(5.8%)和2020年(4.8%)采集的樣品中發(fā)現(xiàn)了弧菌屬(Arcobacter)，而氣單胞菌屬(Aeromonas)和弧菌屬(Vibrio Spp)在2017年11月達(dá)到峰值(分別為0.43%和4.1%)，在DA中還檢測(cè)到其它幾種細(xì)菌病原體(圖5C)，所有時(shí)間均檢出假結(jié)核耶爾森菌（Yersinia pseudotuberculosis），2018年5月達(dá)到峰值(0.00013%)，其他菌種也達(dá)到峰值，如不動(dòng)桿菌屬、肺炎克雷伯菌屬等?；谂囵B(yǎng)的分析證實(shí)，DA和DB位點(diǎn)分別存在22種和18種致病物種(圖5C，D)。對(duì)兩個(gè)城市的宏基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行直接分類(lèi)。每個(gè)數(shù)據(jù)集中的宏基因組組裝基因組(MAG)數(shù)量從7到23個(gè)不等，相對(duì)豐度在0.215%到1.325%之間。然而，對(duì)MAGs的注釋結(jié)果表明，它們都不含有毒力因子，說(shuō)明該方法只能檢測(cè)高豐度的病原體。
圖4.湛江地區(qū)細(xì)菌群落動(dòng)態(tài)研究
6.湛江水樣細(xì)菌病原菌基因分型
在DA和DB中分別鑒定出4種和13種副溶血性弧菌的序列類(lèi)型 (sequence types，STs)。在10份湛江樣品中有3份分離到ST1740和ST1799。湛江城區(qū)共分離到4株霍亂弧菌STs(ST69、ST1170、ST1171和1株新的STs)，其中ST69屬于O1大流行血清群。在城市和農(nóng)業(yè)樣品中均檢出肺炎克雷伯菌ST23、ST35和ST86。城區(qū)樣品中檢出三株流行基因型ST11、ST34和ST13沙門(mén)氏菌，并出現(xiàn)在廣東省臨床樣品中。
7.湛江水樣中病毒的檢測(cè)和基因分型
湛江宏基因組數(shù)據(jù)中3.2%的reads分類(lèi)為DNA病毒序列，其中97.8%對(duì)應(yīng)細(xì)菌噬菌體。2017年和2019年還檢測(cè)到四種人類(lèi)病原體，其中包括與兒童腹瀉有關(guān)的Tanapox病毒。2018年5月后，湛江也檢測(cè)到低豐度的猴痘病毒和Human herpesvirus 6，2019年5月，檢測(cè)到很低(0.001%)的Swinpox病毒，可能由于其低豐度然而，qPCR檢測(cè)未檢測(cè)到上述病毒。對(duì)于RNA病毒，使用微流控芯片和qPCR技術(shù)在2018年11月、2019年5月和11月湛江樣品中檢測(cè)出諾如病毒，載量分別為3.4×104、1.78×103和2.9×103拷貝/L，2018年11月檢測(cè)到豬札幌病毒(Sapovirus)，為3.2×103拷貝/L，但常規(guī)PCR沒(méi)有擴(kuò)增出這些病毒的DNA片段。
8.機(jī)會(huì)性病原體豐度定量和WGS
兩個(gè)城市的樣品宏基因組數(shù)據(jù)中給定病原體在多個(gè)點(diǎn)的相對(duì)豐度顯著增加。例如，2018年4月，DG樣本中A. baumannii, Acinetobacter lwoffi和 Acinetobacter junii增加了100倍以上，2018年10月，DY樣本中發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基Aeromonas media增加了10倍以上(圖2)。東港水樣的qPCR檢測(cè)表明，污水中病原菌豐度在7.1×104~1.33×109拷貝/L之間。2018年4月和2020年4月，A. junii, A. baumannii和A. lowffii三種細(xì)菌在DG中的豐度超過(guò)了半數(shù)致死量（LD50）水平。
從湛江樣品中選擇了4株無(wú)MLST方案的病原菌，A. junii , V.alginolyticus, S. algae 和A. hemolyticus進(jìn)行全基因組測(cè)序（WGS）。結(jié)果表明，V. alginolyticus與本地水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)的菌株有親緣關(guān)系，表明它們是該地區(qū)特有的(圖5A)。S. algae ZJ61與我國(guó)山東的4株臨床分離株有親緣關(guān)系，而S. algae ZJ-SH在一個(gè)獨(dú)立的分支上(圖6B)。結(jié)合75個(gè)A. junii基因組進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，2018年?yáng)|港水樣分離株JZ20與2020分離株JZ102(圖6C)聚為一類(lèi)。對(duì)57個(gè)A. hemolyticus基因組分析，湛江分離株ZJ54與從醫(yī)院分離的SZ3452有親緣關(guān)系(圖6D)，分離株HK30與醫(yī)院的菌株XH900聚在一起。
圖5.根據(jù)Vibrio alginolyticus (A)Shewanella algae (B) Acinetobacter junii (C) Acinetobacter haemolyticus (D)核心基因組序列，
用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)本研究中獲得的分離株用星號(hào)表示
9.污水樣本的公共衛(wèi)生風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估
細(xì)菌：低風(fēng)險(xiǎn)，在宏基因組數(shù)據(jù)中可以檢測(cè)到病原體，但不能培養(yǎng)；中風(fēng)險(xiǎn)，宏基因組數(shù)據(jù)中檢索到病原體及其關(guān)鍵毒力基因，但沒(méi)有分離到致病基因型；高風(fēng)險(xiǎn)，在隨后的分離和MLST能確認(rèn)致病基因型。病毒：中風(fēng)險(xiǎn)，qPCR/微流控芯片/宏基因組數(shù)據(jù)檢測(cè)到；高風(fēng)險(xiǎn)，用傳統(tǒng)的PCR可進(jìn)一步擴(kuò)增。
對(duì)兩個(gè)城市采樣地點(diǎn)的公共衛(wèi)生風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行了評(píng)估，通過(guò)與VFDB數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，確定了95種參考病原體。主要毒力因子包括(1)毒素，(2)鞭毛和菌毛，(3)脂多糖和抗原，(4)致病島。
24個(gè)物種含有關(guān)鍵的毒力因子，這些因子在不同的水樣中情況不同，因此城市和農(nóng)業(yè)水樣有不同的健康風(fēng)險(xiǎn)特征。2020年4月收集的東港城市污水總體健康風(fēng)險(xiǎn)最高(圖6A)，包含1種病毒病原體高風(fēng)險(xiǎn)和6種細(xì)菌病原體高風(fēng)險(xiǎn)。2019年至2020年，報(bào)告的甲型肝炎病例有所上升，同時(shí)甲型肝炎病毒的在樣品中濃度很高。從2017年-2020年病例數(shù)增加數(shù)量（183-622例）和病毒檢測(cè)量（增加10倍）不一致，可能是因?yàn)槌鞘信R床監(jiān)測(cè)還沒(méi)建立起來(lái)，無(wú)癥狀或未被識(shí)別的患者未被報(bào)告，這突顯了環(huán)境監(jiān)測(cè)的重要性。此外，農(nóng)業(yè)污水中ASFV、蠟狀芽孢桿菌和腸球菌有高風(fēng)險(xiǎn)，需要干預(yù)以保證食品安全。
湛江水樣結(jié)果表明A. baumanni, B. cereus, C. jejuni, E. coli, K. pneumoniae, S. enterica, S. sonii, S. pneumoniae和V. cholerae在城市地區(qū)具有很高的健康風(fēng)險(xiǎn)(圖6B)。其中，2018年5月采集的廢水中含有7種高風(fēng)險(xiǎn)病原體，Aeromonas sp., B. cereus和V. parahaemolyticus是農(nóng)業(yè)污水的主要關(guān)注對(duì)象，湛江的城市和農(nóng)業(yè)廢水中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)高風(fēng)險(xiǎn)病毒病原體。
圖6.東港(A)和湛江(B)污水樣品中細(xì)菌和病毒病原體的公共衛(wèi)生風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)
藍(lán)色：低健康風(fēng)險(xiǎn)；灰色：中等健康風(fēng)險(xiǎn)；紅色：高健康風(fēng)險(xiǎn)
總結(jié)
該研究提出了一種同時(shí)檢測(cè)多種毒力基因的污水公共健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估框架，該框架具有很大的病原體環(huán)境監(jiān)測(cè)應(yīng)用潛力。廢水監(jiān)測(cè)是可視化病原體動(dòng)態(tài)和提供病原體與疾病之間關(guān)系的重要洞察力的有力平臺(tái)。在農(nóng)村，臨床監(jiān)測(cè)或報(bào)告系統(tǒng)不夠充分，這一風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工具還可以監(jiān)測(cè)農(nóng)村地區(qū)病原體的流行病學(xué)。
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